空肠弯曲菌外膜蛋白rOMP18的克隆表达及抗原性分析＊

乔 博,孟凡亮,顾一心,何利华,张 姝,肖 迪,刘国栋,曹芳芳,张建中,张茂俊

空肠弯曲菌(Campylobacter jej uni,C.jej uni)属于嗜热微需氧革兰氏阴性弯曲菌,是引起人类急性腹泻常见的病原体之一[1]。在许多国家的腹泻患者中所占的比重已居首位,部分国家亦仅次于沙门菌或志贺菌。发展中国家空肠弯曲菌的感染率明显高于发达国家,通常为发达国家的10～100倍[2]。除肠炎外,其研究证明空肠弯曲菌中某些菌株的感染还与格林-巴利综合征(Guillain-BarréSyndrome,GBS)的发生有关[3]。

血清抗体的检测结果通常不作为空肠弯曲菌感染的诊断依据,但患者针对空肠弯曲菌抗体滴度的变化对于分析空肠弯曲菌感染后导致 GBS的病因分析具有重要意义[4]。目前空肠弯曲菌血清抗体检测试剂缺乏,为获得检测空肠弯曲菌抗体的特异诊断抗原,本研究拟对空肠弯曲菌外膜蛋白18(outer membrane protein 18,简称 OMP18)进行克隆表达,并进一步检测其抗原性。

OMP18是由空肠弯曲菌omp18基因编码的分子质量为18kD的外膜蛋白,该蛋白在弯曲菌属中普遍存在,在同一个弯曲菌种内又高度保守。因此OMP18抗原性评价对于空肠弯曲菌感染血清学诊断候选抗原的研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料 空肠弯曲菌(ICDCJ07001由本科室分离保存);表达质粒pET32a(+)(Merk公司)和菌株E.coliBL21(DE3)(天根公司);Ex Taq酶,限制性内切酶B amH I和XhoI,T4 DNA连接酶,(TaKaRa公司);琼脂糖凝胶切胶回收试剂盒,质粒小提试剂盒(天根公司);IDA His-Bind预装纯化柱(Novagen公司);辣根过氧化物酶标记 rSPA(北京博奥森生物技术公司);兔免疫血清(本科室)。

1.2 方法

1.2.1omp18的保守性分析在NCBI上下载已测序的omp18基因序列及其编码的氨基酸序列,分别为 C8J_0106、JJD26997_0120、CJ E0108、CJJ81176_0148、CJ0113、ICDCCJ07001_106。运用 Vector NTI Suite 6分析其保守性。

1.2.2 PCR扩增 运用Swiss-Prot(http://www.expasy.ch/sprot/)预测OMP18蛋白的信号肽,Primer 5.0设计OMP18去掉信号肽后对应基因的引物。上游引物:5′-B amHⅠCGCGGA TCC TGTAGCACAAAAA GCACTAGCGTA;下游引物:5′-X hoⅠCCGCTCGAG TCTTGA TAATTTAAATTCAGCACG,该引物由上海生工公司合成。PCR 扩增体系为50μl:10×buffer 5μL,dNTP 1μL,ICDCCJ07001 DNA(模板)2μL,上、下游引物各1.25μL(20μmol/L),Ex Taq 酶 (5U/μL)0.5μL,ddH2O 39μL。PCR扩增条件:95℃,预变性5min,然后按以下参数进行30个循环:94℃变性30s,58℃退火 30s,72℃延伸 2min,最后 72℃延伸10min,4℃保存。取 PCR产物50μL,1.5%的琼脂糖凝胶(0.01‰GelRed染色),80V电泳50min,在凝胶电泳成像仪下切胶。

1.2.3 pET32a-om p18重组质粒的构建 将琼脂糖凝胶切胶回收的omp18 PCR产物和质粒pET32a(+)分别用B amHⅠ和X hoⅠ进行双酶切,酶切体系为30μL:10×K buffer 3μL,PCR产物与质粒pET32a(+)各 18μL,B amH Ⅰ与XhoⅠ各1.5μL,ddH2O 6μL。30℃酶切 1h,37℃酶切 2h。酶切产物用1.5%的琼脂糖切胶回收。omp18和pET32a(+)以摩尔比3∶1的比例混合加入 T4连接酶16℃过夜连接。取连接产物5μL转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞,将转化菌均匀涂布于含氨苄青霉素(AMP100μg/mL)的 LB平板上,37℃过夜培养后挑选单菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃,180r/min过夜孵育,质粒小提试剂盒提取质粒,进行单、双酶切鉴定,阳性重组质粒命名为pET32a-omp18。

1.2.4 OMP18的诱导表达、存在状态分析及纯化将阳性克隆子菌落接种到5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃,200r/min摇至菌液浓度OD约为0.8～1.0时加入终浓度为1mmol/L的IPTG,30℃诱导表达4h。于两个离心管内分别吸取菌液样品各1mL,0.01 mol/L的PBS洗菌两遍,其中一管加入终浓度为1×SDS-PAGE上样缓冲液,100℃水浴5min,12 000g离心5min,取上清用于表达产物分析。另一管超声破碎菌体分离上清和沉淀,上清中加入终浓度为1×SDS-PAGE上样缓冲液,沉淀先以30μL生理盐水悬浮混匀,再加入终浓度为1×SDS-PAGE上样缓冲液,这两样品用于分析重组蛋白的存在状态。将上述样品进行SDSPAGE电泳分析,5%浓缩胶和12%分离胶电泳,考马斯亮蓝R250染色。OMP18纯化采用的是 IDA His-Bind预装纯化柱,按其说明书操作。

1.2.4 Western-blot分析 表达产物SDS-PAGE电泳后将凝胶,滤纸,PVDF膜置于转膜液中浸泡活化30min后,至半干式电转印仪25V转印60min,用含0.1%Tween20的 TBS(TBST)洗膜5次,每次5min,然后转入封闭液(1×PBS+0.5%脱脂奶粉)中,4℃封闭过夜;取出 PVDF膜,用 TBST洗膜5次,每次5min;加入1∶50一抗反应液(空肠弯曲菌免疫前、后兔血清)37℃缓慢摇动孵育60min;取出PVDF膜用 TBST洗膜 5次,每次 5min;加入1∶40 000二抗反应液(辣根过氧化酶标记rSPA)37℃缓慢摇动孵育60min;洗膜后加入DAB(6mgDAB、10uL H2O2、1×PBS稀释至10mL)显色后用蒸馏水终止反应。

2 结 果

2.1omp18基因测序菌株DNA保守性分析

2.1.1om p18基因的保守性分析以om p18基因前200bp为例,显示omp18基因及其编码的氨基酸序列具有高度保守性,见图1。

2.1.2omp18编码氨基酸的保守性分析 见图2

2.2 PCR扩增om p18及重组质粒的酶切鉴定PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,结果显示扩增产物在444bp左右(图3)。将重组表达质粒经B amHⅠ和X hoⅠ单、双酶切后在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳(图4),获得预期大小的基因片段,表明表达质粒构建成功。

图1 omp18(1-200bp)DNA序列比对分析Fig.1 Comparison of DNA sequence foromp18(1-200bp)inC.jej uni

图2 OMP18氨基酸序列比对分析Fig.2 Comparison of amino acid sequence forOMP18 in C.jejuni

图3 omp18基因扩增结果Fig.3 Results of PCR product ofomp18 1.DNA markerⅤ;2.PCR product ofomp18

2.3 rOMP18存在状态分析及纯化表达产物经SDS-PAGE分析结果参见图5,从图中可看出诱导后的pET32a-omp18有表达,该蛋白以包涵体形式存在,沉淀经8mol/L尿素溶解后用 His纯化柱纯化得到较高纯度的重组rOMP18蛋白,该重组蛋白是与纯化标签 HIS结合的融合蛋白,分子量为34kD(HIS16kD)左右。

2.4 Western-blot分析 Western-blot结果见图6,rOMP18蛋白对空肠弯曲菌免疫兔血清有较好的抗原性(图中第8条带)。

3 讨 论

外膜蛋白通常是病原细菌的疫苗成分以及特异诊断抗原的候选蛋白。鞭毛蛋白A(flagellin A,FLA),外膜蛋白 PEB1(periplasmic solute-binding protein 1,PEB1),外膜蛋白 PEB3(periplasmic solute-binding protein 3,PEB3)已被证实其在空肠弯曲菌中的抗原性[9],但是FLA蛋白抗原性的多变与其f la基因型多变是一致的[7-8]。而且空肠弯曲菌有很多蛋白是受温度调控的蛋白。因此寻找一个抗原性稳定的蛋白对空肠弯曲菌的免疫学诊断具有重要的意义。

图4 pET32a-omp18重组质粒酶切鉴定Fig.4 Results of recombinant plasmid pET32a-omp18 ested by endoenzymes1.DNA MarkerⅢ;2.pET32a-omp18 esterd by Bam HⅠandXhoⅠ;3.pET32a-omp18 esterd by Bam HⅠ

图5 转化体BL21-OMP18表达产物的SDS-PAGE电泳Fig.5 SDS-PAGEandlysis for BL21-OMP181.protein molecular weight standard;2.rOMP18 before induction in BL21;3.rOMP18 after induction in BL21;4.precipitation in BL21;s5.upermatant in BL21;6.purified products of rOMP18

图6 rOMP18的Western-blot分析Fig.6 Western blot analysis of products of rOMP18 1,5.protein molecular weight standard;2-6 protein of ICDCCJ07001;3,7.protein ofMycobacterium tuberculosis;4,8.purified products of OMP18

omp18在空肠弯曲菌内是单拷贝基因,长498bp,其中(G+C)约为 33.5%,编码 165个氨基酸。Vector NTI Suite 6分析显示omp18也是保守基因,Andre B[9]等人用该基因的引物扩增了从不同宿主(人、狗、鸡等)体内分离到的空肠弯曲菌都能得到阳性的扩增条带,又用southern-blot验证了弯曲菌中空肠弯曲菌(C.jejuni)、结肠弯曲菌(C.coli)、胎儿弯曲菌(C.lari)、乌普萨拉弯曲菌(C.upsaliensis)、瑞士弯曲菌(C.helveticus)omp18基因的普遍性并具有相似性。

OMP18蛋白属于细菌的PALs(peptidoglycanassociated lipoproteins)蛋白家族,PALs在细胞外膜与肽聚糖之间起桥联作用参与细胞壁的构成并保持其完整性[10]。OMP18蛋白在空肠弯曲菌内普遍存在,分子量大小为18kD,其 N端的前18个氨基酸组成信号肽,指导OMP18蛋白定位在空肠弯曲菌的表面[4]。与空肠弯曲菌OMP18蛋白相似相似的外膜蛋白有:流感嗜血杆菌(Haemophilus inf luenzae)的外膜蛋白PAL(P6)有36%的氨基酸序列相似[11],与大肠杆菌(Escherichia coli)的 PAL蛋白有32%的氨基酸序列相似[12],但用空肠弯曲菌制备的OMP18单克隆抗体验证了其能与所有弯曲菌的OMP18蛋白结合与幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌等无非特异性反应[9]。本研究建立的用pET32a(+)载体表达 ICDCCJ07001的OMP18蛋白是去掉信号肽后,其N端与载体上6个连续的组氨酸标签相连接的融合蛋白,并且pET32a(+)的组氨酸标签为后续的纯化工作提供了便利。Western-blot检测rOMP18蛋白能与空肠弯曲菌免疫兔血清结合,证明该重组蛋白具有抗原性。本研究所用的一抗是三组抗体包括了不同血清型的空肠弯曲菌菌株,分别为 GBS爆发株、GBS散发株、腹泻株。ICDCCJ07001是2007年导致我国长春发生GBS暴发的空肠弯曲菌,用此菌株做为克隆表达的模板可以初步验证OMP18蛋白在我国临床标本中的抗原性,为以后大量标本的检测奠定基础。

本研究成功构建了空肠弯曲菌rOMP18基因的原核表达系统,并分析了表达产物的抗原性,为空肠弯曲菌血清学诊断提供了候选抗原。

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