我国甲病毒的分离与鉴定

李文娟,王志玉,梁国栋

甲病毒是指披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(A lphavirus)病毒,是一类以蚊虫等吸血节肢动物为传播媒介,引起人畜疾病的重要病原体。国际病毒分类委员会2009年第9次报告确认目前共发现29种甲病毒,其中有l3种可引起人、畜疾病,至少9种发生过人间流行[1-2]。自上世纪80年代以来,随着我国虫媒病毒研究的发展,相继分离到多种甲病毒;在人群和动物中检测到多种甲病毒抗体;并且发现多例甲病毒感染的输入性病例[3]。甲病毒研究在我国虫媒病毒研究领域取得了较大进展。本文就近30年来我国甲病毒研究进展进行综述。

1 辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)

1987年,在云南省发热病人的血清标本中分离到 YN87448病毒[4];1990年,从新疆自治区的按蚊中分离到XJ-160病毒[5];2005年,从云南省的三带喙库蚊中分离到MX10病毒[6]。经血清学鉴定和分子生物学鉴定,YN87448、XJ-160和MX10病毒均为 SINV。系统进化分析发现,XJ-160病毒在SINV古北区/埃塞俄比亚基因型中形成单独的进化分枝,提示XJ-160病毒是该基因型的新亚型[5]。YN87448病毒与SINV南非分离株S.A.AR86全部非结构基因的核苷酸同源性为98.8%,结构基因的核苷酸同源性为99%,二者的亲缘关系最近,但是在生物学特性上存在较大差异:S.A.AR86能使成年小鼠产生神经症状而导致死亡,而 YN87448不会致成年小鼠死亡,序列分析提示,YN87448在非结构基因的乳白突变和核苷酸缺失可能导致其毒力下降[7-8]。MX10病毒与 SINV马来西亚分离株MRE16、YN87448、XJ-160的 E1基因核苷酸同源性分别为90.0%、73.1%、72.0%;进化分析显示,MX10病毒属于SINV澳大利亚/东方型。

XJ-160病毒1990年分离后,在分子生物学方面开展了较为深入的研究。通过对XJ-160病毒全基因组序列测定和分析,阐明了该病毒基因组与其他SINV之间的差异,明确XJ-160病毒属于辛德毕斯样病毒(Sindbis-Like virus)[5]。发现 XJ-160病毒的结构蛋白基因可引起宿主细胞的凋亡[9];外源导入的siRNA通过降解病毒RNA抑制XJ-160病毒的复制,并且具有明显的序列特异性、位置效应和量效关系[10]。完成了XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建,并利用感染性克隆进一步构建了具有我国自主知识产权的XJ-160病毒复制子型表达载体[11-12]。研究发现,XJ-160病毒的 nsP1基因第 565和 577位核苷酸(对应 169Lys和173Thr)突变与否直接影响到全基因克隆的感染性,并构建了稳定表达XJ-160病毒全部结构蛋白的包装细胞系BHK-21E+Capsid,证实了 E2蛋白尤其是145-150位氨基酸与硫酸肝素的相互作用在SINV感染细胞过程中起到决定性作用[13-15]。一些研究结果发表在国际杂志,使我国甲病毒的研究跻身国际行列。

血清流行病学调查发现,在我国多个省市存在SINV抗体阳性人群[16]。云南省健康人群和发热病人中均存在SINV抗体[17];当地野鼠中也检测到SINV抗体[17];海南省、广东省和福建省也存在SINV抗体阳性人群和动物[18-19];福建省从病毒性脑炎患者血清和脑脊液中检测到 SINV IgG抗体[20],提示SINV可能是我国病毒性脑炎的病原体之一。

SINV是甲病毒属的代表株,l952年首次分离于埃及尼罗河三角洲地区的单条库蚊,SINV对人类不仅可引起发热、皮疹和关节炎等症状,而且引起的疾病能够发展为慢性疾病[21],该病在非洲、北欧、亚洲等地均有流行,尤其是在芬兰,每隔7年发生一次暴发流行,对当地的公共卫生产生严重影响[22]。

2 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)

1986年,从云南省的蝙蝠脑组织中分离到1株病毒(B8635)[23],蚊虫标本中分离到 3株病毒(M26,M80,M81)[24]。1993年,在海南省采集的蝙蝠和致倦库蚊中分离到2株病毒(HN36,HN24)[25]。经血清学检测,上述6株病毒对标准CHIKV抗体的中和效价分别为320、1 000、6 761、676、1 000和1 585[23-25],提示这些病毒为CHIKV,但是迄今尚未对这些病毒株进行分子生物学鉴定。

血清流行病学调查,云南省健康人群中CHIKV抗体阳性率为 9.23%,部分地区高达43.78%[17];而在海南省、广东省等地人群中也检测到CHIKV抗体[18]。多种野生动物和家畜中也存在CHIKV抗体,其中以云南省棕果蝠的阳性率最高,达49.30%,其次为鸟类的36.84%,推测这些动物可能在病毒的自然循环中发挥一定作用[18,23]。这些结果提示我国人群和动物中存在 CHIKV感染。

截至目前,在我国尚无基孔肯雅病流行的报道,但是输入性病例时有发生。2008年3月,在广州市发现2名由来自斯里兰卡的基孔肯雅病的输入性病例;2008年10月,广东省茂名市发现2名来自马来西亚的输入性病例;2008年11月,在广州市发现了1名来自马来西亚的输入性病例[3]。通过RT-PCR从上述5例病人血清中检测到CHIKV的 E2基因序列,并从其中4例患者血清标本中得到CHIKV全基因组序列,系统进化分析发现,这也4条全基因组序列均位于CHIKV印度洋基因型分支内;这也是我国首次从输入性病例标本中分离到CHIKV的报道[3]。

CHIKV在分类上属于甲病毒属西门里克森林脑炎病毒抗原复合群成员,1953年首次分离自乌干达1例发热病人血清标本。对人类主要引起发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血等症状[26]。该病主要流行于非洲和东南亚地区,近年来在东非海岸、印度洋岛屿、印度及东南亚地区也多次发生爆发流行,已成为世界上流行范围最广的甲病毒[27]。

3 罗斯河病毒(Ross river virus,RRV)

1993年,在海南省三亚市捕获的蝙蝠脑组织中分离到1株病毒(HBb17)[28]。HBb17病毒在实验条件下能在蚊体内复制,并通过蚊媒传播使小鼠发病死亡。经血清学检测,HBb17病毒与RRV的抗原性最接近[28]。序列测定及分析显示,HBbl7株与RRV(国际标准株 T48病毒)在3′U TR(un-translated region)核苷酸同源性为99%,结构基因 E1核苷酸同源性为99%,系统进化分析显示,HBb17病毒与RRV处在同一进化分支,表明 HBb17病毒分离株为RRV29],这是国内首次报道分离到RRV。

血清流行病学调查发现,在海南省健康人群中RRV抗体阳性率为3.07%,且集中在琼中和三亚地区,当地发热病人中 RRV抗体阳性率则达到8.70%,但是同处于南方的广东省人群中则没有检测到 RRV抗体[18]。在海南省野鼠中也检测到RRV抗体[18,28]。由于 HBbl7病毒分离株来自海南省捕获的蝙蝠标本,并且在海南省健康人群、发热病人和野鼠中均检测到RRV抗体,提示该病毒可能在海南省形成自然循环,并可能是引起当地人群发热的病原,但迄今未见病毒再分离的报道。

RRV是属于甲病毒属西门里克森林脑炎病毒抗原复合群,1963年首次分离自澳大利亚东部海岸平原地区;对人类可引起全身性疾病,主要表现为发热、头痛、关节痛、皮疹、淋巴结肿大,主要流行于澳大利亚和西南太平洋地区[30]。

4 盖塔病毒(Getah virus,GETV)

1964年,在海南省的库蚊中分离到1株病毒(M1),实验条件下M1株能在埃及伊蚊和致倦库蚊中增殖,且新生小白鼠被感染M1株的埃及伊蚊叮咬后,骨骼肌发生退化、萎缩、坏死和肌纤维的炎症改变,经分子生物学鉴定M1为 GETV[31],此后相继在河北省分离到 2株 GETV(HB0234,HB0215)[32],云南省分离到2株 GETV(YN0540,YN0542),上海市分离到 4株 GETV(SH05-5,SH05-15,SH05-16,SH05-17),甘肃省分离到1株GETV(GS10-2)[33]。病毒核酸序列分析显示我国分离的 GETV进化关系很近,形成一个相对独立的类群。进一步的分析发现,我国分离的 GETV存在特有的序列特点,其进化关系与分离年代相关[33]。

血清流行病学调查结果显示,云南省健康人群中GETV抗体阳性率为3.20%,恒河猴中也存在GETV抗体[17];海南省健康人群和发热病人中均检测到 GETV抗体,阳性率分别为10.3%和26.4%,并且猪、马、羊等家畜的 GETV抗体阳性率也很高(17.6%～37.5%)[31];而从外地来海南省的驻军人员中GETV抗体明显低于当地人群[34],提示在海南省当地存在GETV的流行。

GETV为甲病毒属西门里克森林脑炎病毒抗原复合群成员。1955年,GETV首先从马来西亚的霜背库蚊中分离到[35]。广泛流行于东南亚地区,马来西亚、印度、巴基斯坦、日本等国家均报道有GETV感染。GETV对马可以引起发热、荨麻疹和后肢水肿,孕猪感染后会引起流产,在人血清中检测到GETV的中和抗体,但是对人尚未有引起疾病的报道[33]。

5 马雅罗病毒(Mayaro virus,MAY V)

1985年,从云南省的蚊虫和发热病人中分离到11株病毒,其中10株分离自蚊虫,1株分离自发热病人血清标本;酶免疫法显示,这11株病毒均与甲病毒属抗体反应,尤其与MA YV反应最强,而交叉中和试验则与MA YV无交叉中和反应,提示这11株病毒与MA YV抗原性相关[36]。1985年,在海南省采集的蚊虫中分离到2株病毒(HN8,HN99);交互快速微量中和试验表明,这2株病毒只与甲病毒属抗体反应,尤其与MA YV的抗原性最为密切[37]。1995年,从海南省捕获的蚊虫标本中分离到1株病毒(HYM1);交叉血凝抑制试验和交互中和试验表明,HYM1与MA YV抗原性关系密切[38]。上述病毒通过血清学初步鉴定为MA YV,但是未见这些病毒基因序列测定和后续病毒分离的报告。

血清流行病学调查发现,在海南省的健康人和多种家畜血清中均检测到MA YV抗体[37-38];而在驻海南省官兵中则未检及[34],这可能与当地人群长期居住,受感染的机会比较到多,而驻地官兵多来自外省,服役时间短,感染机会相对较少有关。

MA YV在甲病毒分类中属于西门里克森林脑炎病毒抗原复合群成员,可引起急性传染病,以发热、头痛、关节痛和皮疹为特征。1954年,MA YV首先在特立尼达Mayaro的发热病人血清中分离到。广泛分布于南美洲热带森林地区,在特立尼达、玻利维亚和巴西曾发生过爆发流行[39]。

6 东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus,EEEV)

1992年,从新疆博尔塔拉地区采集的全沟硬蜱中分离到1株病毒(XJ-91031)[40]。EEEV抗体对XJ-91031病毒的中和指数可达1000,初步鉴定XJ-91031病毒为 EEEV[41]。血清学调查发现,在多个省市的人群中检测到 EEEV抗体[16]。2000-2002年,福建省15例病毒性脑炎患者中检测到 EEEV的IgG抗体[42]。

EEEV于1933年首次分离自美国东部病死的马脑,主要分布在美洲。EEEV主要侵犯中枢神经系统,表现为高热、脑炎和精神神经症状等[43]。在美国,1964-2008年间人感染 EEEV的病例报告257例,而马的病例则数以千计。

7 西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus,WEEV)

1990年,在新疆自治区乌苏县采集的尖音库蚊中分离到1株病毒(XJ-90260);1991年,在新疆自治区北部地区采集的全沟硬蜱中分离到1株病毒(XJ-91006)[40]。病毒分子生物学研究提示,XJ-90260和 XJ-91006病毒的 NSP4、E1和 3′U TR核苷酸同源性均为100%;3′U TR核苷酸序列具有典型的WEEV特征,与标准WEEV(California株)的同源性达99%[44-45]。血清流行病学发现,在我国多个省区人群中均检测到XJ-90260病毒的抗体,总阳性率为2.71%[45]。

WEEV于1930年首先分离自美国西部病死的马脑组织,病毒感染引起动物和人的发热症状和中枢神经系统疾病。据美国 CDC统计,从1964-2005年间共报告639例人类感染WEEV的病例,病死率为3%～7%。主要分布于美国和墨西哥,并蔓延至加拿大、巴西等美洲大部分地区[43]。

8 未分类甲病毒

除上述已鉴定的甲病毒外,我国还报道一些甲病毒分离物,但是尚未得到系统鉴定,见表1。1983-1988年,从海南省采集的蚊和蜱分离出28株病毒[46];1990-1991年,从新疆自治区采集的蚊和蜱中分离到17株病毒[40];1994年,从山东省烟台市捕捉的蚊虫中分离到15株病毒[47],1998年,在海南省不明原因发热患者血中分离到2株病毒(HF-7和HC-6)[48]。这些病毒经理化和生物学鉴定符合甲病毒特征,血清学检测提示为甲病毒。

9 结 语

9.1 加强我国甲病毒引起疾病的诊断 目前我国已经分离到多种甲病毒,其中包括引起人类发热和关节痛等症状的辛德毕斯病毒、基孔肯亚病毒和罗斯河病毒等,也包括可以引起人或动物如马脑炎的西方马脑炎病毒和东方马脑炎病毒及盖塔病毒等,但是所有在我国分离到的甲病毒仅有病毒分离(仅有部分文章介绍少量血清流行病学信息)的报道,均缺乏病毒引起疾病的报道,尽管这些病毒的分离为解释我国夏秋季节各地流行的不明原因发热和不明原因病毒性脑炎等提供了病原学线索,但是还不能确定我国存在由这些甲病毒引起的疾病。为此要加强我国甲病毒引起疾病的证实工作。其中最重要的工作是在临床发现由甲病毒感染病例的病原学确定诊断,并对相关病例采集多种标本开展研究,最主要的是病例组织标本中的病原学证据,还要采集病例急性期与恢复期双份血清开展病毒中和试验,关注双份血清中病毒特异抗体滴度存在4倍及以上的差异。

疾病的诊断是一个系统工程,需要多个单位和部门的密切配合、通力协作。临床医生要能够认识甲病毒引起的疾病症状,只有早期识别病人才能够及时采集标本开展试实验室检测以确认甲病毒与疾病的关系。甲病毒感染病人的早期诊断也依赖于研究单位建立特异及实用的甲病毒感染的检测方法和检测试剂。快速、简便的诊断方法不仅能够提高甲病毒感染的实验室诊断率,而且可以积累充足的临床和流行病学资料,为分析甲病毒感染的临床特征、疾病预后、流行情况提供基础资料,并进一步评估其引起的疾病负担,为我国甲病毒疾病的预防和控制

提供科学依据。

表1 我国近30年新分离甲病毒

9.2 加强我国甲病毒的监测 甲病毒主要由蚊虫传播也被称为“蚊传虫媒病毒”,近30年来,我国从库蚊、阿蚊、按蚊、伊蚊标本中分离到多种甲病毒,其中在三带喙库蚊分离的甲病毒最多,此外我国还从蝙蝠组织、蜱标本甚至病例标本分离到甲病毒,提示我国可能广泛存在甲病毒。但是我国分离的甲病毒中除了辛德毕斯病毒和盖塔病毒外其他病毒仅有1次病毒分离的报导,为开展后续研究带来了困难。为此必须加强我国甲病毒的监测,开展多种媒介生物中甲病毒分离和鉴定工作,特别是对一些仅有1次分离报道的甲病毒进行再分离,进一步积累我国的甲病毒资料。开展我国甲病毒传播媒介的研究,掌握我国甲病毒的自然循环规律为我国甲病毒疾病的预防和控制提供基本信息。

9.3 加强我国新分离甲病毒的分子生物学鉴定与研究 我国新分离的甲病毒中还有一部分病毒仅仅依靠ELISA或IFA等血清学方法的鉴定结果,由于甲病毒之间存在较严重的血清学交叉反应,要做到病毒种类的鉴定需要开展交叉中和试验或进行病毒基因序列的分析等。特别是开展我国分离甲病毒的全基因组序列的测定与分析,以病毒基因组序列分析我国分离病毒与国外分离株的分子进化。这样既可以从分子水平确定其分类地位,也可以了解我国分离株与国外流行株的分子差异和进化规律等。

(本工作在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所完成,在此谨向有关专家致谢。)

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