1株海洋真菌ZH2.1的鉴定及生物学特性初步研究

雷晓凌，李学恭，佘志刚，蔡小玲，钟敏，杨志娟

(1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524025;2.中山大学化学与化工学院，广东广州510275)

海洋无脊椎动物能在竞争异常激烈的生境中繁衍生息，主要依赖于自身拥有的强大化学防御机制。从海洋无脊椎动物组织里分离到的活性化合物，很多并非是这些无脊椎动物产生的，而是与其共生的海洋微生物产生的［1］。由于许多海洋天然产物在结构上与微生物天然产物极其相似，共附生于海洋无脊椎动物的微生物一直被认为是这些化合物真正的产生者［2］。近年来，从海洋环境中寻找微生物新种和具有特殊功能的生理活性物质，已成为国内外的研究热点［3-5］。海洋真菌由于其次生代谢产物的化学多样性丰富、产量高而成为海洋天然产物研究的一类重要生物资源［6-7］。菌株ZH2.1是从南海一种海鱼消化道中分离得到的1株真菌，其发酵液对金黄色葡萄球菌有较强的抗性，并具有较强的抗肿瘤活性，本文通过传统的形态学鉴定方法，并结合18S rDNA序列分析对其进行鉴定和生物学研究，为进一步研究该菌及其活性物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株菌株ZH2.1分离自南海海域白姑鱼，由广东海洋大学食品科技学院实验室保存。

1.1.2 试剂Taq聚合酶、dNTPs、琼脂糖购自北京鼎国生物技术发展中心;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自AxyGEN公司;pMD18-T Vector购自TaKaRa公司;实验中所用培养基均购自北京陆桥技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基种类对菌株生长的影响在PDA平板、察氏平板和马丁-孟加拉红平板上分别点植菌株ZH2.1，28℃培养3～10 d，观察菌落形态，颜色，产色素情况，表面渗出物情况。培养基均用海水配置，并添加抑菌剂。

1.2.2 形态学分类根据菌落外部形态及孢子器、孢子梗、孢子等的形状，结合真菌鉴定手册［8-9］初步判定其种属。

1.2.318 S rDNA序列分析采用NS1:5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3';ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为正反向引物(上海生工合成)，以CTAB法提取菌丝体的DNA。PCR反应体系为(25 μL):模板DNA 1.00 μL，10×PCR缓冲液2.50 μL，dNTPs(10 mmol/L)2.00 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.50 μL，Taq聚合酶(5 U/μL)0.30 μL，超纯水18.20 μL。PCR扩增条件:94℃1 min;94℃30 s，57℃60 s，72℃90 s，72℃3 min，35个循环;10℃10 min。PCR产物回收，纯化，目的DNA片段连接至pMD18-T载体，转化JM 109感受态细胞，经质粒酶切鉴定，挑取阳性克隆子进行序列测定。DNA序列由上海生工生物工程技术有限公司测定，将测序得到18S rDNA序列通过Blast与GenBank中的核酸序列进行比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用Clustalx 8.0及Mega 4.0软件构建系统发育树，进行系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌株ZH2.1生长的影响

ZH2.1菌落在PDA培养基中生长较快，第5天菌落直径达47 mm。如图1所示，菌落最初为白色，渐变为粉红色，菌落反面为褐色。菌落呈圆形，平坦，后变为絮状，边缘产淡黄色色素。菌株在以海水配置的PDA培养基、察氏培养基及马丁-孟加拉红培养基中生长情况有较大差异(表1)。

图1 菌株ZH2.1在PDA培养基上的菌落形态Fig.1 The colony morphology of strain ZH2.1 on PDA medium

表1 菌株ZH2.1在不同培养基上的生长特征Table 1 Culture characteristics of strain ZH2.1 on different media

2.2 显微形态特征

培养7～15 d，光学显微镜下观察，菌丝无横隔，分支。分生孢子器烧瓶形，有孔口，壁厚，如图2。孢子卵圆形，有横隔。菌丝形成厚垣孢子，近似圆形，串生。

2.3 菌株ZH2.1的分子鉴定及系统发育关系

2.3.1 菌株ZH2.1 DNA提取及PCR扩增提取菌株ZH2.1的DNA并作为模板，以NS1/ITS4作为引物进行18S rDNA扩增，扩增的片段为2 301 bp，见图3。

图2 菌株ZH2.1产孢器形态(15×40)Fig.2 Pycnidium morphology of strain ZH2.1 on PDA medium(15×40)

2.3.2 菌株ZH2.1系统发育分析以基因组DNA为模板，NS1/ITS4作为引物，PCR扩增得到的菌株ZH2.1的18S rDNA序列全长为2 301 bp，该序列已提交GenBank注册，登录号为FJ450059。将该序列与GenBank数据库中已收录的真菌18S rDNA进行Blast分析，结果表明，菌株ZH2.1的18S rDNA序列与茎点霉属的菌株相似性较高，根据同源性高低顺序，选择其中相似性较高的15株菌的18S rDNA序列，用ClustalX 1.8与Mega4.0软件构建系统发育树。由图4可知，菌株ZH2.1与孔状短小茎点霉Phoma exigua var.exigua(EU167567)处于同一分支，亲缘关系最近，相似性达到98%。综合形态学观察，培养特性及18S rDNA序列分析，初步鉴定菌株ZH2.1为孔状短小茎点霉。

图3 菌株ZH2.1的18S rDNA PCR扩增结果Fig.3 PCR products of strain ZH2.1 18S rDNA

图4 基于菌株ZH2.1的18S rDNA与相关菌种的系统发育进化树Fig.4 The phylogenetic tree of the 18S rDNA of ZH2.1 and the relative strains

2.3.3 NaCl浓度对菌株ZH2.1生长的影响在PDA培养基中添加不同浓度的NaCl，经过培养后，发现菌株ZH2.1在不同浓度NaCl环境中生长情况差异较大，见表2。说明菌落大小和色素的产生与NaCl含量有关;不过NaCl含量对其发酵液的抗菌活性影响不大。

表2 NaCl浓度对菌株ZH2.1生长特性的影响Table 2 Effect of different concentration NaCl on the culture characteristics of ZH2.1

3 讨论

真菌的分类鉴定往往以传统的形态学特征为主，但是真菌形态特征复杂，而且环境的变化对真菌的形态特征影响较大，这可能导致分类系统的不稳定，给分类鉴定工作带来不便。核酸序列特异性较强而且稳定，即不同亲缘关系的物种核酸序列差异较大，真菌基因组中编码核糖体的基因包括4种:28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。它们有不同的进化程度，有的序列比较保守，有的序列进化较快，因此可以根据它们的序列对真菌进行准确的鉴定。

在传统的鉴定方法基础上，进一步通过18S rDNA序列分析构建系统发育关系，可以准确有效地鉴定真菌。本文通过对分离自南海海域海鱼消化道的真菌ZH2.1进行鉴定，综合菌落形态特征、菌体显微特征和18S rDNA序列分析结果，初步鉴定该菌为孔状短小茎点霉。此外，通过耐盐性分析，菌株ZH2.1可以耐受较高的NaCl浓度，最高NaCl耐受浓度达15%，而且也可以在无NaCl的培养基中生长，表明菌株ZH2.1是非专一性的海洋真菌。

菌株ZH2.1分离自海鱼的消化道，而目前国内外有关茎点霉属的研究几乎都来自植物病原菌［10-12］，海洋真菌也仅见红树林内生真菌［13］，未见有从动物中分离到茎点霉属的报道，可能该菌是源于海鱼的饵料。

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