蛋壳内膜分解菌的筛选、鉴定及其所产蛋白酶性质的初步研究

马瑜，李勃*，肖明

(1.陕西省微生物研究所，陕西西安710043;2.西北大学附属中学，陕西西安710069)

蛋壳内膜(eggshell membrane，ESM)是指蛋壳与蛋白之间的一层厚度约70 μm的生物膜，其中有机组分占70%，无机组分占10%，含水量约为20%;有机组分中主要包括一些不溶性的蛋白质，如胶原蛋白(Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅹ型)、骨桥蛋白和骨唾液酸糖蛋白，以及少量的碳水化合物和脂质［1］。蛋壳内膜的骨架结构主要是由角蛋白和粘多糖通过角蛋白分子链间及链内高度的二硫键交联形成内外2层紧密的纤维网状蛋白［2］。因蛋壳内膜中富含的角蛋白及构成胶原蛋白的羟脯氨酸以及透明质酸、粘多糖等多种有机成分与人体皮肤密切相关［3］，所以在医疗卫生、化妆品、生物制药以及轻工等领域都具有很大的应用价值［4］。但是由于蛋壳内膜特有的纤维网状结构使其在自然条件下非常稳定，对于酸、碱以及蛋白酶都具有极好的耐受性，且不溶于水和多种溶剂，因而目前仍是一种无法有效利用的生物质资源［5］。随着我国现代蛋制品加工业的不断发展，在很大程度上改变了原来的蛋壳来源分散、不易收集的情况，但由于不能对其进行有效利用从而造成了资源的浪费，因此对蛋壳及蛋壳内膜资源化研究与开发具有重要的理论与实践意义。本研究从土壤中分离筛选到1株能够有效分解蛋壳内膜的细菌菌株Pes207，通过生理生化试验以及16S rRNA的序列测定确定其为假单胞菌属(Pseudomonas)的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。通过对其发酵产物的分离纯化，从中分离到了一种能够分解蛋壳内膜的蛋白酶，并对其酶学性质进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源土壤样本取自日本兵库县、淡路岛以及西安市周边的农田、家禽养殖厂、家禽屠宰场区。

1.1.2 筛选培养基溶液A:KH2PO40.136 g，Na2HPO4·12H2O 0.68 g，NaCl 0.2 g，NH4NO30.2 g，酵母提取物0.05，蛋白胨1.0 g，ESM(蛋壳内膜)粉0.4 g，H2O 86 mL，pH 7.0;溶液B:MgSO4·7H2O 0.136 g，FeSO4·7H2O 0.68 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，H2O 14 mL，pH 7.0。蛋壳内膜的提取方法参照文献［6］。将配制好的溶液A与溶液B加热充分溶解后于室温下冷却至45℃左右按比例混合，并加入琼脂粉1.5 g/100 mL，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种筛选及鉴定①菌种筛选:称取土壤样品1 g加入装有99 mL无菌水的小三角瓶中，充分震荡均匀，取100 μL悬液，将其滴加在由筛选培养基制备的9 cm培养皿上并用三角刮刀均匀涂布，涂布后的培养皿于37℃培养。培养1～2周，挑取产生明显透明圈的菌落，进一步分离纯化。将纯化后的菌株进行液体发酵，并测定发酵液中ESM蛋白酶的活力;②菌种鉴定:菌株Pes207的形态观察及理化测试参照文献［7］进行。参照文献［8］，根据原核生物16S rRNA的保守序列合成引物:Primer A:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3';PrimerH:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR扩增反应条件:95℃2 min;95℃1 min，50℃2 min，72℃2.5 min，共35次循环;72℃延伸5 min。PCR扩增产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检查，并以QIAEX II Gel Extraction System(Qiagen)回收纯化后交北京华大基因科技有限公司进行序列测定。采用DDBJ中FASTA程序比对所测DNA序列，并利用Clustalx 1.83及MEGEA 4.0软件构建系统发育树。

1.2.2 蛋白含量及酶活力测定①蛋白含量测定:使用Folin-酚试剂法［9］，于600 nm下测定溶液的光吸收并根据标准曲线计算蛋白含量;②酶活力测定:发酵液经离心去除菌体，取0.3 mL稀释50倍的上清液置入0.8 mL 0.6%的酪蛋白溶液(pH 8.0)中，充分摇匀后迅速取出0.55 mL反应液置入含有0.5 mL 10%TCA的eppendorf管，并置于冰浴中终止反应;其余反应液于30℃水浴中反应1 h后加入0.5 mL 10%TCA终止反应，并于13 000 r/min，10 min，4℃条件下离心，取0.2 mL离心后的上清液置入2.5 mL Na2CO3-NaOH溶液中，30℃水浴10 min，加入0.2 mL Folin-酚试剂，反应30 min后于600 nm下检测其吸光度值，并计算酶活力。酶活力定义:在pH 8.0，30℃条件下反应1 h使反应液在600 nm的光吸收增加1所需的酶量为1个酶活单位(U)。

1.2.3 酶的提取及纯化①盐析法提取粗酶:将发酵液于室温下离心除去菌体及杂质后，提取上清液作为粗提酶液。将粗酶液进行40%硫酸铵饱和盐析后取上清液，再进行80%硫酸铵饱和盐析，离心后收集沉淀。将沉淀用少量0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)溶解并装入透析带，4℃下透析过夜;②离子交换柱层析:具体方法见文献［10］。将透析后的酶液加入CM52(Cellulose CM52)层析柱，以0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)进行洗脱收集，并测定每管的蛋白含量及酶活力。合并活性最高的3管收集液，于4℃下用pH 8.0的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液透析过夜。将透析后的收集液加入DE52(DEAE Cellulose DE52)层析柱，以0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)进行洗脱，测定每管的蛋白含量及酶活力，合并有活性最高的6管收集液。

1.2.4 酶的分子量测定将经过二次离子交换层析所得酶液用SDS-PAGE凝胶电泳法检验其纯化程度，并测定其分子量，具体方法见文献［11］。

1.2.5 酶学性质研究①酶反应的最适温度:在20～90℃范围内，以10℃为增加量下测定该酶对酪蛋白的水解活性;②酶反应的最适pH:在30℃下，利用20 mmol/L的不同缓冲液:醋酸钠缓冲液(pH 3.0～5.5)，磷酸钾钠缓冲液(pH 5.0～8.0)，Tris-盐酸(pH 7.0～9.0)以及碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0～11.0)作为反应体系测定酶活力。在pH低于5.5条件下，以血红蛋白代替酪蛋白作为反应底物;③温度对酶稳定性的影响:将酶在20～90℃下处理10 min，在30℃下测定其残余酶活力;④pH对酶稳定性的影响:pH 3.0～11.0范围内，将酶溶于不同缓冲液(同②)中于4℃下过夜保存后，于30℃下测定其残余酶活力;⑤酶的Km值测定:在pH 8.0，60℃的条件下以不同浓度(S)的酪蛋白为底物溶液，测定酶的反应速度V(以单位时间内吸光度的减少量dA/dt来表示)，以1/V-1/［S］的双倒数法作图，计算Km值。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选结果

通过筛选共发现4株菌株在以ESM为碳源的培养基上生长良好，其中分离自日本淡路岛农田土壤的菌株Pes207对于ESM的分解效果最为显著。如图1所示，图1A中的晶体样片段为研磨后不溶于水的蛋壳内膜碎片，利用Pes207的发酵清液在30℃下处理48 h后，大部分晶体样片段被彻底分解并液化，见图1B。

图1 蛋壳内膜被Pes207所产ESM蛋白酶分解的效果Fig.1 Decomposition of the eggshell membrane digest by the ESM protease from strian Pes207

2.2 菌株Pes207的生理生化鉴定

显微镜下观察，Pes207菌体为杆状，端生鞭毛，大小约0.8 μm×3.0 μm;不产生芽胞，革兰染色呈阴性，专性好氧。在营养琼脂平板上生长，菌落为微黄色，直径约3～5 mm(见图2)。该菌株的生理生化实验结果见表1。

表1 菌株Pes207的生理生化实验结果Table 1 Physiological and biochemical result of Strain Pes207

图2 菌株Pes207的革兰染色照片Fig.2 Photograph of Strain Pes207 by gram stain

2.3 菌株Pes207的分子生物学鉴定

经测定，菌株Pes207的16S rDNA PCR产物长度为1.5 kb左右。该序列已在DDBJ注册，注册号为AB507253。利用Clustal 1.83对菌株Pes207的16S rDNA序列和DDBJ中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，对比结果发现菌株Pes207与多株恶臭假单胞菌(Psedumonas putida)的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99%以上，结合生理生化鉴定结果，可断定菌株Pes207为假单胞菌属(Psedumonas)的恶臭假单胞菌(Psedumonas putida)。利用MEGA 4构建的NJ法系统发育树见图3。

图3 Pes207的N-J法系统发育树Fig.3 The N-J Phylogenetic tree of strain Pes207

2.4 Pes207所产ESM蛋白酶的分离纯化结果

图4 ESM蛋白的离子交换层析图Fig.4 Ion-exchange Chromatography curve of ESM protease

将Pes207的发酵液进行盐析及二次离子交换层析后的结果见表2。其层析结果见图4，经过二次离子交换层析后目标蛋白的相对酶活力增加了34倍，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳显示为单一条带(图5)，经测定其分子量约32 ku。

表2 ESM蛋白酶分离纯化结果Table 2 Separation and purification of ESM protease

图5 ESM蛋白酶的SDS-PAGE电泳Fig.5 SDS-PAGE of ESM protease

2.5 Pes207所产ESM蛋白酶的基本性质

经测定，该蛋白酶的一些基本性质，如最适反应pH、最适反应温度、热稳定性，不同pH条件下的稳定性，以及Km值等如表3所示。

表3 纯化后的Pes207所产ESM蛋白酶的性质Table 3 Characteristics of the purified ESM protase of Pes207

3 讨论

随着社会的不断进步与发展，如何有效利用自然界中的生物质资源正在受到日益广泛的重视。诸如甲壳素、壳聚糖、胶原蛋白等物质，由于其均取材于生物体自身合成的材料，对人体与动物具有一定的亲和性，因此在医用材料、制药以及化妆品制造等领域具有较高的商业价值。另外，这些物质通常是从食品、农产品加工业的废弃物中提取，因而成本低廉，不但具有开发价值同时有利于保护环境。

因其特殊的膜结构及水不容性，富含角蛋白及胶原蛋白等多种有机成分，蛋壳内膜成为近年来开始受到关注的又一种生物质资源。尽管有研究报道［12-13］利用蛋壳内膜作为吸附材料富集废水中的重金属离子取得了良好的效果，但由于其稳定的膜结构，难溶于水和有机溶剂，使得其应用仍然受到很大限制。如何有效分解蛋壳内膜，从中提取水溶性蛋白质或多肽并加以利用，是未来开发此类资源的关键所在。而利用微生物方法来降解蛋壳内膜相比化学法操作简便、成本低廉，是实现其资源利用的一种有效手段［14-16］。

本研究从日本淡路岛土壤中分离得到1株能够直接分解并液化蛋壳内膜的菌株Pes207(Psedumonas putida，AB507253)，经研究发现该菌株能够产生一种可直接分解蛋壳内膜的蛋白酶，通过二次饱和硫酸铵盐析及二次离子交换层析的方法从其发酵液中纯化出了该酶，经SDS-PAGE电泳测定其分子量约32 ku，同时对纯化后的蛋白酶的基本性质作了初步研究，实验结果表明该菌株所产蛋白酶为碱性蛋白酶类，在30～70℃，pH 5.5～9.0的条件下具有良好的稳定性，具有一定的开发潜力。下一步计划对该酶蛋白的氨基酸序列以及其分解蛋壳内膜的产物进行分析，并进一步深入研究其酶学性质及作用机理。

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