乳糖酶研究进展

张敏文，顾取良，张博，李荷

(广东药学院生物化学与分子生物学系，广东广州510006)

1 乳糖酶的来源及其特性

乳糖酶存在于植物、细菌、真菌、放线菌以及哺乳动物(特别是婴儿)的肠道中。目前只有来源于微生物的乳糖酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取乳糖酶，具有酶源丰富、产量高、生产成本低、周期短的特点，而且不受季节、地理位置等因素的影响，不同微生物来源的乳糖酶的性质差别较大(表1)。

2 乳糖酶的基础研究

2.1 乳糖酶的基本结构及其生物合成

对乳糖起水解作用的酶是乳糖酶根皮苷水解酶(lactase phlorizin hydrolase，LPH)。LPH是一种肠上皮细胞微绒毛膜上的糖蛋白，具有乳糖酶和根皮苷水解酶活性，最适pH为5.5～6.0。LPH为一条多肽链，有乳糖酶和根皮苷水解酶的作用位点，并通过COOH末端的一段疏水氨基酸序列连接在肠牯膜微绒毛膜表面。前乳糖酶原由位于氨基末端的信号肽域、前导肽域、胞外域、疏水的跨膜锚定区、羧基末段的胞内段组成，在信号肽引导下进入内质网经过一系列修饰，乳糖酶原进入高尔基体后被O-糖基化，然后经历细胞内和肠腔的2次裂解后形成成熟的乳糖酶。

2.2 乳糖酶与基因克隆

1969年哈佛大学beekwith博士研究小组应用DNA分子杂交技术首次分离得到大肠埃希菌乳糖酶基因，揭开了构建乳糖酶基因库的序幕，已经有很多种来源的乳糖酶基因被克隆。Juajun O等［4］从芽胞杆菌DSM13中克隆出乳糖酶的基因，Rhimi M等［5］从乳酸杆菌属的菌种中克隆出一种表达乳糖酶的基因，并且都在大肠埃希菌中进行表达，重组酶的温度和pH的适应性范围都更宽。王政等［6］利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。

2.3 乳糖酶与基因多态性

自2002年Enattah提出根皮苷水解酶基因上游C/T-13910和G/A-22018变异型是LD的基因标志物以来，关于这2个单核苷酸的研究很多。对数百个肠黏膜活检的分析表明，基因型C/C-13910与乳糖酶活性(＜10 U/g蛋白)呈负相关，而基因型C/T-13910和T/T-13910与乳糖酶活性呈正相关。C/C-13190基因型在北俄罗斯种群中的比例是35.6%，其他C/T-13910基因附近和与乳糖酶活性有关的基因在调查中没有发现，这些乳糖酶不持续表达的人群对牛奶的消耗比乳糖不耐受的群体低，但是不显著［7］。在老年人群中调整乳制品摄入量，证明C/T-13910基因多态性还和肥胖相关［8］，对于单基因底物延展技术处理过的基因型为C/T-13910的病人，在摄入50 g乳糖之后进行呼气氢试验［9］，26%的病人是CC基因型积极反应，74%是CC基因型消极反应(其中48%是TC基因型，26%是TT基因型)基因频率没有变化，在CC基因型中，基因型和呼气氢试验是相关联的。

Oct-1、GATA、叉头框和HNF-4α结合位点等构成乳糖酶增强子，变异型C/T-13910位于增强子的中央，变异型T-13910转录活性是C-13910的3～6倍。在乳糖酶基因上游的基因G-13914也和乳糖酶基因活性增强有关［10］。Oct-1和HNF-4α结合位点在基因C/G-14010周围，实验证明基因型C-14010比G-14010对Oct-1亲和力更强［11］，3-磷酸甘油醛脱氢酶与Oct-1具有相互作用，可解释二者共纯化问题［12］。超迁移分析表明，Oct-1能直接同变异型T-13910结合，且强于Oct-1与变异型C-13910之间的结合［13］。变异型C-13910和T-13910均能增强乳糖酶启动子的活性。对未分化的Caco-2细胞研究发现，与包含C-13910的区域相比，包含T-13910的区域使乳糖酶启动子的活性增加25%～75%［14］。

3 乳糖酶的应用

3.1 在乳产品中的应用

3.1.1 解决结晶问题由于乳糖结晶在浓缩乳制品或者冷冻制品中往往造成产品的(砂状组织)缺陷，若在加工中添加20%～30%的乳糖水解酶，不但可以防止结晶现象发生，还可以增加产品的甜度，减少蔗糖用量。

3.1.2 发酵乳制品中的应用用乳糖水解乳制造酸乳，可以缩短乳凝固时间约15%～20%，且由于乳酸菌生长快，菌数多，能延长酸乳的货架期，产品黏度也较大，若水解程度较大时，甜度也增加。因此，在制作水果酸乳时不仅可减少糖的用量，而且水果的风味也会增强;用乳糖水解乳加工干酪时，可缩短凝乳时间，并使凝块坚实，还可减少排除乳清时造成的损失，产量可增加10%。

3.1.3 作为替代添加剂乳清和超滤乳清中的乳糖部分水解可增加产品的甜味，提高糖的溶解度。不同比例的葡萄糖和半乳糖混合物的甜度相当于蔗糖甜度的65%～80%，溶解度增加3～4倍，这种糖浆的总固形物含量达75%，可代替卵蛋白和蔗糖制作面包、饼干和蛋糕等，还可代替加糖浓缩牛乳制作牛乳软糖等，且不会出现纹理、沙包、乳糖结晶和焦糖等现象。乳糖溶液经乳糖酶水解形成半乳糖和葡萄糖的混合液，称为半乳糖葡萄糖糖浆。其甜度与等质量分数的蔗糖相近。可代替蔗糖用于各种点心、饮料、罐头食品及冰淇淋和雪糕的加工，效果很好。

“尉曰：‘今将军尚不得夜行，何乃故也！’”原文用“曰”字，并没有用表示霸陵尉态度的明显词语，而在英文翻译中却有“the watchman retorted”，“retorted”有反驳、回嘴之意，带有抵抗意味。汉语原文中有很多都是直接“某某曰”，没有表示人物情感态度的词语，在英译过程中加入表示情感态度变化的词语，有助于读者体会人物的心境。

3.1.4 低聚半乳糖的生产低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖为原料，经β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键，生成半乳糖和葡萄糖，并通过转半乳糖苷的作用，将水解下来的半乳糖苷转移到乳糖分子生成的。低聚半乳糖具有较强的耐酸性、耐热性，不会因为在加工过程中的高温杀菌及人体胃酸所分解而失去其本来应有的特性，而且能有效地被双歧杆B菌和乳酸杆A菌同时利用，因此低聚半乳糖的生产和应用也相当广泛［15］，特别是在日本，随着人们越来越注重健康，低聚半乳糖将会有很大市场。

3.2 促进果蔬成熟及软化

软化是果实成熟的重要标志，是一个复杂而有序的过程，涉及一系列生理生化反应。果实成熟过程中初生细胞壁在细胞壁多糖降解酶的作用下，细胞壁多糖发生降解，高聚物解离，细胞壁组织变软导致果肉软化。乳糖酶可以使细胞壁的组分变得不稳定，并通过降解具支链的多聚醛酸使果胶降解或溶解，使果实软化。庄军平等［16］利用已报道的乳糖酶基因的保守序列设计引物，从香蕉果实中得到900 bp左右的1个片段，该片段的氨基酸序列与芦笋、草莓、番茄、芒果及鳄梨等果实相应的基因相似性分别是85.5%、80.9%、80.5%、79.1%、76.3%。

阚娟等［17］采用气相色谱法测定不同成熟时期桃果实的乙烯释放量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性的变化，发现乳糖酶不同于多聚半乳糖醛酸酶，其作用主要与桃果实成熟前期果实的软化启动密切相关。

3.3 乳糖酶作为检测衰老细胞的标志

1995年Dimri首次提出了一种可在体内鉴别衰老细胞的生物学标志乳糖酶，报道中提出体内或体外的衰老成纤维细胞和角质细胞均表达此酶，而休眠细胞和终末分化细胞则缺乏，永生细胞中也无此酶的表达。因此此酶可以作为检测衰老细胞的重要标志。Kurz DJ等［18］基于一些间接生理实验得出衰老细胞溶酶体中的乳糖酶活性增加。陈俊香等［19］的研究结果表明随增龄，大鼠肾组织乳糖酶表达逐渐增强。然而也有研究对此质疑，Bo Yun Lee等［20］通过研究得出乳糖酶的活性之所以在衰老细胞中增加是通过溶酶体乳糖酶基因(GLB1)的编码，而且在衰老细胞中溶酶体乳糖酶蛋白的表达也会增加，得出乳糖酶并不是衰老细胞的标志。

3.4 在医药领域的应用

乳糖酶可作为助消化类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如原发性乳糖酶缺乏，因胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻等，且对新生儿无毒害作用。用于治疗乳糖不耐受的乳糖酶药物还可与其他抗生素联用，与杜迪和思密达治疗轮状病毒肠炎能明显有效地缩短病程，疗效确切，治愈率高［21］。此类药物可调整肠道正常菌群，拮抗轮状病毒，对肠黏膜上皮细胞损伤有一定治疗效果。很多药物中都含有乳糖酶，如乳糖酶冻干酵母制剂、酵母乳糖酶肠溶微囊制剂等。

医学上乳糖氢呼吸检查(H(H(2)-BTs))被广泛用于诊断乳糖酶缺陷，最常见的是乳糖不耐受症状的诊断，Oberacher M等［22］通过3个呼吸实验说明这个呼吸测试对乳糖酶缺陷具有良好的敏感性和特异性，呼吸实验可以简化但时间无法缩短。研究发现对乳糖的分解能力也可作为一些疾病发生风险的标志［23］，实验测试者对乳制品食物消化后，双歧杆菌和大便乳酸菌的检测表明某些疾病的发生风险和乳制品食物的摄入有关。对于乳糖不耐受的治疗，用乳酸杆菌和半乳糖苷酶治疗乳糖不耐症的病人，通过氢呼吸实验的结果可知，乳酸杆菌和半乳糖苷酶都强烈提高胃肠道对乳糖的摄入吸收。由此可知益生菌对于乳糖不耐受治疗持续性较好［24］。

3.5 乳糖酶基因在基因工程中的应用

3.5.1 在载体构建中的应用乳糖酶基因编码的产物水解底物X-gal，可呈现蓝色，易于检测和观察，在构建表达载体LacZ基因置于启动子下游，通过蓝白斑来筛选阳性重组载体。

3.5.2 作为报告基因的应用乳糖酶是一种常用的报告基因分子，经常与荧光素酶报告基因一起转染细胞，被用作荧光素酶报告基因检测的内参照，从而消除因为质粒的转染效率不同而带来的误差。汪国忠等［25］以β-galactosidase质粒为报告基因，将其与自制氟碳气体微泡黏附，制备载基因微泡。利用诊断性超声破裂微泡进行体外心肌细胞基因转染，采用原位染色及酶学定量检测βgalactosidase表达水平，同时进行细胞活性检测。

其作为报告基因还用于研究启动子的效能和启动子不同位点突变对表达效能的影响。陈晓月等［26］为检测构建的枯草芽胞杆菌分泌表达载体

pGPST中启动子和信号肽的活性，将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点，构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ。

3.5.3 构建产乳糖酶基因工程菌利用基因工程技术，可以将活性高的乳糖酶基因导入易于培养、生产繁殖迅速的微生物体内，从而降低乳糖酶生产成本。Domingues等［27］利用絮状酿酒酵母和黑曲霉中含有编码分泌胞外乳糖酶的LacA基因构建重组菌株，使重组酿酒酵母菌株能够分泌可高效利用乳糖的乳糖酶。Ibrahim等［28］使用化学诱变剂对2株双歧杆菌、乳植杆菌和嗜热链球菌进行诱变，筛选高产菌株，长双歧的诱变菌株产酶量比野生型增加2倍多。为了获得高产菌株，新基因工程菌不断出现。生产酶的工程菌以大肠埃希菌、酵母菌为主，还有嗜热链球菌、乳杆菌等［29］。

4 低温乳糖酶的研究

由于低温乳糖酶有其本身的优越性，近年来已成为研究的热点，很多科学家都开始研究南极等那些常年冰封的土壤或者湖中的微生物［30-32］，已报道低温乳糖酶产生菌有嗜冷菌和耐冷菌，通过16S rRNA序列分析可知，大多数低温乳糖酶产生菌为节杆菌(Arthrobacter)和交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)［33］。

在我国，周春雷等［34］从北冰洋楚科奇海、加拿大海盆、格陵兰海和中国南极中山站近岸的海水、海冰和沉淀物样品中分离出322株低温细菌中筛选出73株低温乳糖酶产生菌，通过研究其产生的乳糖酶具有较好的适应低温特性。马宏伟等［35］从内蒙古宝格达山高山冻土以及乳制品中分离到25株嗜冷菌，利用产低温β-半乳糖苷酶模型筛选，获得1株低温酶高产菌株。史应武等［36］从新疆高寒冻土、冷冻乳制品及生乳中分离到101株耐冷菌，利用低温β-半乳糖苷酶筛选模型，获得1株低温酶高产菌株，并且对菌特性和酶特性进行了研究。

1株新的具有低温乳糖酶活性的菌株从北极的土壤中被分离出来，对应的基因被克隆并且在大肠埃希菌中表达，分析DNA序列得知其属于糖基化水解酶家族2［37］。Białkowska AM等［38］从南极土壤中分离出的节杆菌属的菌20B，其本身是低温菌，且产的乳糖酶也是低温酶，Wang K等［39］从土壤基因组文库中分离出一种新的β-半乳糖基因ZD410，分析结果表示，该序列编码的蛋白由672个氨基酸组成，其分子量为78.6 ku，由于此基因表达的β-半乳糖苷酶在低温条件下有较高活性，把此种酶认定为一种低温酶。James A等［40］发现微小的结构基因的改变都会影响乳糖酶的热稳定性，bgaS3基因有在低温环境下恢复蛋白活性的作用，BgaS26和BgaS7基因改变的酶和含有BgaS基因的酶有相似的最适温度和热稳定性。BgaS7提高了酶在15℃的活性，而且在2.5℃水解80%的乳糖酶所用的时间是BgaS的一半。

5 结论

随着科学技术的发展和人们对乳糖酶的进一步研究，乳糖酶的应用范围越来越广，将来乳糖酶的应用就不仅仅局限于解决乳糖不耐受问题，还将在食品、医药、环保、基因治疗等各个领域发挥重要作用，具有广阔的市场前景。

由于近年来低温乳糖酶的研究成为热点，乳糖酶的生产成本也将大幅降低，乳糖酶的适应性也将提高。目前，本实验室也正在从我国寒冷地区的土样中对低温乳糖酶产生菌株进行筛选并且将克隆其基因到大肠埃希菌中表达，随着研究的深入，低温乳糖酶的工业化生产及其在各个方面的应用将会逐步实现。

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