海水及海产品中溶藻弧菌的分离与鉴定

张晓艳，宁喜斌

(上海海洋大学食品学院，上海201306)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是腹泻病原菌中的一员，为专性嗜盐性弧菌。与其他致病弧菌一样，广泛分布于海洋和江河入海口的水域中，并且数量居海水类弧菌之首［1］，过去一直被认为不致病或仅能引起部分创伤性感染而未受到重视，近年研究证实该菌与副溶血弧菌一样是常见的病原菌［2-5］，为海洋环境的主要优势菌种之一［6］。溶藻弧菌可引起人类食物中毒、中耳炎和败血症等［7］，夏季是养殖动物感染溶藻弧菌发病的主要季节，容易发生该菌引发的重大流行病，对我国特别是南方地区的海水养殖造成巨大威胁。目前，我国国标中对溶藻弧菌的检测方法还没有具体规定，探讨海水及海产品中溶藻弧菌的分离鉴定方法，对其进行安全控制及以后建立溶藻弧菌的检测标准具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株溶藻弧菌标准菌株V.a ATCC 17749，购于上海复祥生物公司。

1.1.2 样品50份海水采集于上海东海近海，40份大黄鱼购于上海市水产市场，30份南美白对虾购于上海市南汇新芦苑农贸市场，25份贻贝购于浙江嵊泗。

1.1.3 培养基及主要试剂3%NaCl的TCBS琼脂、3%NaCl三糖铁琼脂、无盐蛋白胨等培养基及鉴定用的生化试剂购于上海市疾病预防控制中心;科玛嘉弧菌显色培养基购于上海科玛嘉微生物技术有限公司;细菌柱式基因组DNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒及所用引物等均购于生工生物(上海)有限公司;琼脂糖购于加拿大Bio Basic INC公司;EB购于上海华舜生物工程有限公司;DNA MakerⅠ购于天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.4 主要仪器PCR仪(PTC-200，美国Bio-Rad公司);凝胶成像系统(GelDoc XR，美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品的取样及处理用无菌海水采样器于东海近海不同区域采集海水，取水面下30～100 cm深处的海水，每个点取2份，每份500 mL，共50份海水。在上海市水产市场购买新鲜的大黄鱼，共40份，将购置的样品鱼用75%乙醇体表消毒后，无菌取其内脏、鳃及鱼肉等。上海市南汇新芦苑农贸市场购买新鲜的南美白对虾，共30份。20份贻贝购于浙江嵊泗，先用自来水将其外壳上的污泥冲掉，用75%乙醇消毒外壳边缘，敲开外壳，以无菌操作取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。将不同的水产品于灭菌的研钵中充分研碎，或用灭菌剪刀充分剪碎，取10 g样品，放于装有90 mL的3%NaCl的碱性蛋白胨水中，37℃增菌24 h。

1.2.2 细菌的分离培养增菌后，接种于3%NaCl的TCBS上，37℃培养18～24 h，每平板上挑取1个黄色菌落转接至科玛嘉弧菌显色培养基，37℃培养18～24 h，挑取单个无色菌落经2～3次纯化后，转接于3%NaCl营养琼脂斜面20～25℃保存。

1.2.3 溶藻弧菌的初筛挑取可疑菌株进行革兰染色及氧化酶试验［8］，依次将可疑菌株分别接种于3%NaCl三糖铁琼脂斜面以及无盐蛋白胨水和3%、6%、10%盐蛋白胨水，37℃培养18～24 h。

1.2.4 溶藻弧菌的生化鉴定对于初筛试验中疑似溶藻弧菌的菌株进一步做生化鉴定，包括蔗糖、乳糖、MR试验、V-P试验、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、明胶、脲酶、阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、D-纤维二糖及ONPG试验。试验方法参照文献［8］，以溶藻弧菌标准菌株ATCC 17749作对照。1.2.5溶藻弧菌的PCR鉴定挑取可疑菌株的单菌落，接种到TSB液体培养基中，37℃摇床培养12～16 h，取3 mL菌液按照柱式基因组DNA提取试剂盒的方法提取DNA，-20℃保存备用。根据文献［9］，HSP60基因序列是鉴定溶藻弧菌的特征基因，在GenBank中存取号为AY332570，PCR可扩增出560 bp的条带，若能在菌中检测到此序列，则为溶藻弧菌。

2 结果与分析

2.1 溶藻弧菌的初步分离

图1 溶藻弧菌在TCBS琼脂上的菌落形态Fig.1 Colonial morphology of V.a on TCBS agar

图2 溶藻弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上的菌落形态Fig.2 Colonial morphology of V.a on CHROMager vibrio

样品选择性增菌后，在3%NaCl TCBS上的典型菌落为圆形黄色、大而光滑、湿润、较扁平(图1);在3%NaCl科玛嘉上的典型菌落为圆形无色、较小且湿润(图2)。其中145份增菌液在TCBS琼脂上得到黄色单菌落的有52份，从52份TCBS琼脂上各挑取1个黄色单菌落转接至科玛嘉弧菌显色培养基上，得到无色菌落34份。这34株菌转接斜面常温保存1份，作为初步分离的菌株，做进一步的初筛试验。

2.2 溶藻弧菌的初筛

将在科玛嘉弧菌显色培养基上得到的34株可疑菌株进行镜检，34株均为革兰阴性菌，排列不规则，常呈短状，略显弧状。将镜检后的34株菌株依次做氧化酶、三糖铁及嗜盐性试验后。溶藻弧菌氧化酶呈阳性;在3%NaCl三糖铁琼脂斜面上产酸变黄，底层产酸变黄，不产H2S，不产气;在无盐蛋白胨水中不生长，在3%、6%、8%、10%盐蛋白胨水中生长，其中在3%及6%盐胨水中生长较明显。其中34株可疑菌株经过氧化酶试验、3%NaCl三糖铁试验和嗜盐性试验后有1株在10%盐蛋白胨水中不生长，初筛得到33株可疑菌株。

2.3 溶藻弧菌的生化鉴定

对照溶藻弧菌标准菌株的主要特征进行生化试验鉴定，结果见表1。所有鉴定项目中除MR试验(+/-为27/6)和精氨酸脱羧酶试验(-/+为30/3)外，其他生化试验均与溶藻弧菌标准菌株V.a ATCC17749相符合，所以根据生化鉴定结果来看，初筛得到的33株均疑似为溶藻弧菌。

表1 分离菌生化特征及其与标准溶藻弧菌的比较Table 1 Comparison of isolated strains with standard V.a in biochemistry tests

2.4 溶藻弧菌的PCR鉴定

从海水及海产品中分离的33株经过生化方法鉴定后，PCR均扩增出560 bp的溶藻弧菌HSP60基因。部分溶藻弧菌PCR扩增结果见图3，其中条带3、4、5、9、10、11比较亮，条带6、7、8较暗，进而从分子水平验证了分离得到的33株菌株均为溶藻弧菌。

图3 部分分离的溶藻弧菌PCR扩增电泳图谱Fig.3 PCR products of part V.a

2.5 溶藻弧菌的分离率

从海水及海产品中分离得到33株溶藻弧菌(表2)，其中海水中检出9株，大黄鱼检出10株，南美白对虾中检出9株，贻贝中检出5株，其中南美白对虾中检出率最高，高达30.0%。

表2 溶藻弧菌的分离率Table 2 The isolating rate of V.a from samples

3 讨论

溶藻弧菌选择性培养基和显色培养基的选择:145份样品增菌后在TCBS琼脂上分离得到的52份黄色菌株，转接到科玛嘉弧菌显色培养基得到34份无色菌落，经过生理生化及分子水平上鉴定有33株为溶藻弧菌。TCBS虽然是一种选择性培养基，但是在其长成黄色菌落除了溶藻弧菌，还有霍乱弧菌，而霍乱弧菌在科玛嘉显色培养基是土耳其兰色，溶藻弧菌是无色的。所以在分离溶藻弧菌时选用TCBS选择培养基的同时，结合科玛嘉弧菌显色培养基分离，淘汰初筛阶段的其他弧菌，可以较大的提高检验的准确性。因此，可以将科玛嘉弧菌显色培养基用于分离溶藻弧菌检验的国家标准及其他标准中。

溶藻弧菌分离鉴定方法的优化:分离不同样品中溶藻弧菌时，可将其进行增菌后选用选择性培养基TCBS进行分离，挑取黄色可疑单菌落接种于科玛嘉弧菌显色培养基上，挑取无色单菌落进行生化鉴定，根据溶藻弧菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌间不同的生化特征，可选用V-P、蔗糖、阿拉伯糖、ONPG及嗜盐性试验简化验证，最后用分子生物学方法进一步鉴定。

海水及水产品中溶藻弧菌带菌率分析:从50份海水中分离鉴定得到9株溶藻弧菌，检出率为18.0%。该结果略低于韩善桥等［10］报道的海水中溶藻弧菌的检出率为25.9%，原因可能与本研究采样的时间和地点有关，对于海水中溶藻弧菌的携带率，应该引起海洋养殖户和专业技术人员的重视，采取必要的措施来预防溶藻弧菌疾病的爆发和流行。从95份海产品中分离得到24株溶藻弧菌，检出率为25.2%。其中南美白对虾的检出率较高于大黄鱼与贻贝，这说明海产品中携带溶藻弧菌的几率比较高，在食用海产品或海产品加工过程中应采取有效的灭菌方法。

近年来我国的食品安全问题愈发突出，而食品安全问题之一便是微生物问题，而作为海水类弧菌数量之首的溶藻弧菌，对我国的海水养殖构成了很大的威胁。因此，溶藻弧菌的分离鉴定显得愈发重要，其方法的优化对更方便、快速、准确的鉴定溶藻弧菌具有重要的意义。

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