耐甲氧西林金黄色葡萄球菌染色体盒的研究进展

孙丹丹，马笑雪，胡建，罗恩杰

(中国医科大学基础医学院微生物学教研室，辽宁沈阳110001)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，为一种革兰阳性球菌，广泛存在于人与动物的皮肤、黏膜及外界环境中，可以引起人类多种疾病，包括常见的疖、痈、脓疱病、蜂窝组织炎、中耳炎、各种部位的术后感染和累及深部组织的肺炎、骨髓炎、心肌炎、脑膜炎、心内膜炎、食物中毒、各种脏器的深部脓肿还有累及全身的菌血症、毒素休克综合症等多种疾病，不但感染范围广，而且感染率高［1-4］。甲氧西林进入临床使用后不久就出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)不仅是院内感染的重要病原菌，在社区人群中也是重要的感染源［5-7］。MRSA常常呈多重耐药性，易造成医院感染的暴发流行，已成为临床抗感染治疗的一大难题［8-9］。MRSA对甲氧西林耐药的机制主要是它获得了外源性甲氧西林耐药决定子A(methicillin-resistancedeterminantA，mecA)，该基因能够编码与β-内酰胺类亲和力极低的青霉素结合蛋白2a，从而对β-内酰胺类抗生素产生耐药。mecA基因存在于葡萄球菌盒式染色体(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)中，SCCmec是一种可移动的遗传元件，该元件还携带除mecA基因外的其他抗菌药物的耐药基因，造成多重耐药(Multidrug-resistance，MDR)。SCCmec目前主要分为8型，其中又分为若干亚型。SCCmec的基因型与MRSA的流行背景有关，不同地区的SCCmec基因分型分布可能不同［10-14］。SCCmec元件的组织结构和所含的遗传因子具有高度多样性，SCCmec元件已经被分类为不同的型和亚型。SCCmec元件的许多型、亚型、变型以及缺少mecA基因的SCCmec元件都有报道。本文对SCCmec元件的基本特性及其研究新进展加以描述。

1 SCCmec元件的特点

β-内酰胺是应用到临床实践的首选抗菌药，是目前临床上使用最为有效的抗菌药物之一。甲氧西林，是1960年引进的一种半合成的青霉素，专门用于治疗产β-内酰胺酶的葡萄球菌引起的感染［14］。然而，甲氧西林引入临床应用不到1 a，在临床感染的病例中发现了首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)［15］。MRSA菌株可以产生一种新的青霉素结合蛋白PBP2a(PBP2')，PBP2a(PBP2')降低了与β-内酰胺类抗生素的亲合力，从而对β-内酰胺类抗生素产生耐药性。PBP2a(PBP2')由mecA基因编码，mecA基因位于葡萄球菌盒式染色体上(SCCmec)。根据SCCmec所含J区不同将其分为不同的亚型［16-19］。SCCmec的分型被用来作为检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子流行病学的依据。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的产生是由甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)获得外源性的SCCmec所致。SCCmec有不同的型和亚型，但都拥有几个共同的特点:①保守的末端反向重复序列和整合点处的正向重复序列;②mec基因复合体;③mecA基因上下游存在的保守的基因结构以及负责SCCmec移动的染色体盒重组基因(cassette chromosome recombinase，ccr)［20-21］。

2 SCCmec元件分类的基本概念

根据mec基因复合体和ccr基因复合体组成的不同，SCCmec可以分成不同的基因型别。mec基因复合体和ccr基因复合体是SCCmec元件的主要组成成分，分别负责SCCmec元件的整合和切除以及β-内酰胺耐药表型。

2.1 mec基因复合体

mec基因复合体包含mecA基因、调节基因和插入序列。class A mec基因复合体(class A mec)是复合体的原型，包括mecA基因、位于其上游的调节基因(mecR1)和抑制基因(mecI)、高变区(HVR)和位于其下游的插入序列IS431。class B mec基因复合体包括mecA基因、残缺的mecR1基因由于在mecA基因上游插入IS1272，高变区和mecA基因下游的IS431序列。class B mec基因复合体包括mecA基因、残缺的mecR1基因(由于在mecA基因上游插入IS1272序列所致)、高变区和mecA基因下游的IS431序列。class C mec基因复合体包括mecA基因、缺失的mecR1基因(由于在mecA基因上游插入IS431序列而产生)、高变区和mecA基因下游的IS431序列。有2种不同的class C mec基因复合体;class C1 mec基因复合体的mecA基因上游的IS431序列与mecA基因下游的IS431序列(紧靠着HVR)有相同的方向，然而class C2 mec基因复合体的mecA基因上游的IS431序列的方向是逆转的。C1和C2被视为是不同的mec基因复合体，因为它们很可能是独立的变异体。class D mec基因复合体包含mecA基因和ΔmecR1基因，但是在ΔmecR1基因下游没有插入序列［14-15，22-24］(表1)。

mec基因复合体存在以下特点:①只存在于MRSA中，MSSA缺乏;②不是MRSA所固有的，是染色体上一个外来的插入片段;③不同MRS的mecA基因复合体片段末端都存在相同的插入性重复片段，且插入位置均在SmaI-G段上编码A蛋白的spa基因和腺嘌呤生物合成必须的purA基因之间，表明mecA基因复合体的整合具有位置和方向的特异性;④mec基因复合体片断不稳定，其大到100 kb的片段(包括spa基因)均可以丢失［25-26］。

在通常情况下，mecA基因受阻遏蛋白MecⅠ和跨膜的β-内酰胺信号转导蛋白MecRⅠ调控。当没有β-内酰胺类抗生素存在时，MecⅠ抑制mecA和mecRI-mecⅠ的转录;当β-内酰胺类抗生素存在时，MecRⅠ从胞内段自动催化分裂出具有活性的非金属蛋白酶结构域，后者去除MecⅠ对mecA的阻遏作用，使mecA基因能够转录而产生PBP2a［27］。mecA基因广泛分布于葡萄菌属的多个种中，有人推测其可能存在于一个可移动的遗传元件上，可以在葡萄菌属的多个种中很容易地进行转移。

表1 主要的mec复合体Table 1 The major classes of mec complexes

2.2 ccr基因复合体

ccr基因复合体由ccr基因和其周围的开放阅读框架组成(ORFs)。目前，在金黄色葡萄球菌中经鉴定有3个谱系不同的ccr基因，ccrA、ccrB和ccrC。迄今为止，ccrA和ccrB基因经鉴定分为4种异型，而ccrC只有一种［28］。

ccr复合物包括2个位点特异性重组酶基因ccrA和ccrB，其中位点特异性重组酶CcrA和CcrB通过位点特异性重组作用，可以使多种耐抗生素和耐重金属基因嵌入到SCCmec中;同时不同类型的重组酶CcrA和CcrB识别相应的SCCmec，通过精确的切除和整合作用，使SCCmec整合到葡萄球菌属的染色体上，使不同的葡萄球菌能交换基因信息，适应不同环境和抗生素选择压力。在金黄色葡萄球菌中，根据ccrA和ccrB基因的不同，ccr复合物分成5型:1型(type1)携带ccrA1B1基因，2型(type2)携带ccrA2B2基因，3型(type3)携带ccrA3B3基因，4型(type4)携带ccrA4B4基因，5型(type5)携带ccrC基因［15，29-30］。应用特定的引物并通过常规的PCR分析技术都可以检测出它们的型别。

2.3 J区:mec和ccr基因复合体以外的区域

除了mec和ccr基因复合体外，SCCmec元件还包含3个J区，它构成盒子非必需的部件。这些区域可能携带其他的抗生素抗药性决定簇，起初被称为L-C，C-M，和I-R区域，但是不久后就改称为J区。J1(从前的L-C区)是位于染色体右侧的区域和ccr复合体之间的区域，J2(C-M)是位于ccr基因复合体和mec基因复合体之间的区域，J3(I-R)是位于mec基因复合体和染色体左侧的区域之间的区域。J区和mec-ccr复合体一样，它的许多变异体被用来定义SCCmec亚型［31］。

3 8种当前已确定的SCCmec类型

迄今为止，按照(图1，表2)所使用的标准金黄色葡萄球菌已有8种SCCmec类型。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ这3种SCCmec元件是最先发现的［26，32］。随后又报道了Ⅳ至Ⅷ型的SCCmec［22-23，28，30，33］。但是另外的一个命名新型SCCmec元件的系统，是按照ccr和mec复合体的不同组合进行分类的，例如，Ⅰ型(1B)SCCmec表明SCCmec包含ccr1和class B mec基因复合体。其他所知道的SCCmec类型有Ⅱ型(2A)、Ⅲ型(3A)、Ⅳ型(2B)、Ⅴ型(5C2)、Ⅵ型(4B)、Ⅶ型(5C1)和Ⅷ型(4A)。因此，SCCmec的类型应该按照它们被发现的顺序使用罗马体数字来命名，然后括号里标注上ccr和mec基因复合体的类型(表2)。

据报道Ⅲ型SCCmec元件长度为67 kb，被认为是最长的SCCmec元件［30］。然而，2006年，有报道称这个67 kb的元件是由2个小的SCC元件合成的;是由SCCmercury和Ⅲ型(3A)SCCmec(携带ccr3和class A mec)整合在一起组成的［29，32］。为了避免使SCCmercury与SCCmec混淆，其先前的名字被改为SCCHg。金黄色葡萄球菌HDE288携带的SCCmec元件是首次报道Ⅳ型SCCmec元件的菌株［34］，但是被重新定义为Ⅵ型SCCmec(4B)［28］。

SCCmec各型的发现年代如下:1961年英国ccr基因复合体由ccr基因和其周围的开放阅读框架组成(ORFs)。目前，在金黄色葡萄球菌中经鉴定有3个谱系不同的ccr基因，ccrA、ccrB和ccrC。迄今为止，ccrA和ccrB基因经鉴定分为4种异型，而ccrC只有一种［28］。

ccr复合物包括2个位点特异性重组酶基因ccrA和ccrB，其中位点特异性重组酶CcrA和CcrB通过位点特异性重组作用，可以使多种耐抗生素和耐重金属基因嵌入到SCCmec中;同时不同类型的重组酶CcrA和CcrB识别相应的SCCmec，通过精确的切除和整合作用，使SCCmec整合到葡萄球菌属的染色体上，使不同的葡萄球菌能交换基因信息，适应不同环境和抗生素选择压力。在金黄色葡萄球菌中，根据ccrA和ccrB基因的不同，ccr复合物分成5型:1型(type1)携带发现Ⅰ型SCCmec，也是第1株MRSA(NCTC10442)发现的年代;1982年日本发现Ⅱ型SCCmec，MRSA N315;1985年新西兰发现Ⅲ型SCCmec，MRSA 85/2082;于20世纪90年代发现了不同的克隆Ⅳ型SCCmec;于2004年澳大利亚发现Ⅴ型SCCmec［23］;于2006年葡萄牙发现Ⅵ型SCCmec［28］;Ⅶ型SCCmec2007年发现于台湾［35］。2008年在加拿大发现Ⅷ型SCCmec［22］。随着研究的不断深入，以后可能还会有更多的新型的SCCmec被发现。

8种类型的SCCmec从20.9～66.9 kb，大小不等:Ⅰ(34.3 kb)、Ⅱ(53.0 kb)、Ⅲ(66.9 kb)、Ⅳ(20.9～24.3 kb)、Ⅴ(28 kb)、Ⅵ(20.9 kb)、Ⅶ(35.9 kb)、Ⅷ(32 kb)。Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ仅对β-内酰胺类抗生素耐药，而Ⅱ和Ⅲ则引起多重耐药，后两者起因于多种附加耐药基因整合入

表2 金黄色葡萄球菌中的SCCmec类型Table 2 SCCmec types identified in S.aureus

4 SCCmec亚型的分类

在主要的SCCmec类型中，mec基因复合体和ccr基因复合体以外的区域发现了许多不同的结构(包括插入序列和转座子)，例如在J区。因此，根据J区的多态现象及ccr基因复合体和mec基因复合体的结合类型的变异，SCCmec的每种类型已经更深入地被分类到了亚型［31］。为了避免将新型的SCCmec原件错分类到原有的型或亚型的可能，新型的SCCmec原件的报告应该以这个原件的整个核苷酸序列为依据，而不单是依据PCR产物的大小，这样是会令人误解的。因此，新的SCCmec亚型应该被定义根据J区上存在的特殊的DNA序列，包括(i)J区上特有的基因、拟基因或非编码区，除了J区上可动的遗传因子;(ii)可动的遗传因子，如插入序列、质粒、转座子，它们中的大多数编码耐药的或其他决定子。

迄今为止，有3种方法描述SCCmec原件的亚型:(i)由于J1区的不同，用小写字母表示亚型，例如Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc;(ii)由于可动的遗传因子的存在或缺失而产生的不同，用大写字母表示，例如ⅠA、ⅡA和ⅣA;(iii)由于J1、J2和J3是按照发现的顺序而产生的不同，用阿拉伯数字表示，例如Ⅱ.1.1.1、Ⅱ.1.1.2和Ⅱ.2.1.1。(i)和(ii)这2种命名方法被保留作为通用命名方法［14］。

5 2个或多个SCC原件的组合

近来，经鉴定发现有的SCCmec原件携带2个ccr基因复合体。例如，金黄色葡萄球菌ZH47株携带的SCCmec是由1个含ccrC的SCC和1个携带class B2 mec基因复合体的SCCmec(class Bmec基因复合体的亚类，整合在Tn4001转座子上)及1个2型的ccr基因复合体和与IVc型SCCmec有同源性的J1区共同组成的［37］。虽然这2种SCC原件是串联排列的，但是对应ISS序列的特征性的DR序列在链接区域没有被鉴定出来，经鉴定2个DR序列位于复合元件的末端，表明1个单个的SCCmec包含2个ccr基因复合体。其他的实例包括台湾的TSGH17和PM1这2株金黄色葡萄球菌所携带的SCCmec原件也是这样的［35，38］。这些SCCmec原件是由1个携带含等位基因8的ccrC1的SCC和1个携带class C2 mec基因复合体的SCCmec，携带含等位基因2的ccrC1的5型ccr基因复合体，SCCmec特有的J1区和2端的DR序列共同组成的。经鉴定当1个合成的SCC原件携带2个ccr基因时，ccr基因、SCCmec［22，28，35］。然而，新发现的Ⅷ型SCCmec的J2区与Ⅱ和Ⅲ的高度相似，携带红霉素A等耐药基因［22］。SCCmecⅣ和Ⅴ型基因盒较短，除了携带mecA基因外几乎不带有其他耐药基因，对非β-内酰胺类的抗菌药物敏感［33］。携带Ⅰ型的菌株为原型株，含耐药基因相对较少，除对β-内酰胺类抗菌药物耐药外对其他抗菌药物敏感，多药耐药率低。Ⅱ型菌株携带的耐药基因较Ⅰ型多，除携带β-内酰胺类抗菌药物耐药基因外，其SCCmec基因盒还存在携带氨基糖苷类耐药基因的PUB110质粒和携带红霉素耐药基因的Tn554转座子。Ⅲ型SCCmec是含耐药基因种类最多的一种类型，包括φTn554编码镉抗性，pT181编码四环素抗性，mer编码汞抗性，Tn554编码红霉素和大观霉素抗性等基因。故Ⅱ、Ⅲ型菌株表现为多药耐药［32，36］。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型的SCCmec存在于医院获得MRSA(H-MRSA)中。Ⅳ和Ⅴ型SCCmec基因盒较短，除了携带mecA基因外几乎不带有其他耐药基因，仅表现为对β-内酰胺类抗菌药物耐药。Ⅳ和Ⅴ型SCCmec基因盒主要存在于社区获得性MRSA(C-MRSA)中，由于其长度较短，相对轻便，更易在不同遗传背景的流行株中发生转移，所以往往造成大的暴发流行［23］。此外，SCCmec还携带插入序列，如IS431和IS1272，调控mecA的转录，即ΔmecR1或者mecR1和mecI的转录;IS431和IS1272均能截断mecI和mecR1，从而导致mecA基因的去阻遏作用［36］。mec基因复合体、J区综合的复合物应该与先前所描述的进行对比，以便确定其是否隐藏任何SCCmec现存的类型。此外，SCCmec原件与额外的ccr基因的联合应该被用来鉴定是否这2个ccr基因的存在是由于2个独立的SCC元件整合所引起的，又或者这个复合体是由于含有DR序列的ISS序列的初始结合区域缺失的2个元件的融合而产生的［14，39］。

最后，金黄色葡萄球菌的ZH47的元件被分类为Ⅳ型SCCmec元件(2B＆5)，金黄色葡萄球菌的TSGH17和PM1的元件被分类为Ⅴ型SCCmec元件(5C2＆5)，即使PM1的原件暂时已经有报道为Ⅶ型SCCmec［22］。根据拟定的标准线，金黄色葡萄球菌HU25菌株携带的SCCmec被报道为ⅢA型SCCmec，它应该是2个SCC元件的一个合成物，这2个SCC元件为SCCHg和Ⅲ型SCCmec［40］，因为在2个元件的接合处携带特殊的核苷酸序列的这个区域被删除而且仅含有2个DR序列，一个位于orfX的下游，另一个在Ⅲ型SCCmec末端的右侧，这些是可以被检测到的［34］。

或许许多这样的复合元件将被发现，因为原始的接合区域的缺失似乎频繁的发生。使用当前的PCR技术对SCCmec分型的方法，从2个元件串联后的结构存在来辨别复合元件的存在那是很难的。因此，新型元件携带2个ccr基因不应该给予1个罗马数字作为一个新的类型，但是根据复合元件中现在已知的SCCmec类型应该作为1个SCCmec类型的变异体。

6 不含mecA的SCC元件的分类

经鉴定在葡萄球菌中发现了不携带mecA基因的SCC元件，但是它携带其他特殊的基因(例如，荚膜基因簇、夫西地酸耐药基因、汞抗性操纵子)。这些元件都具有SCCmec的特征:在ccr基因复合体内携带1个ccr基因(ccrAB或ccrC);整合在葡萄球菌染色体的ISS;位于DR序列的侧面。

在命名SCC元件时可以在其词尾加上基因的名字或是它们的功能。例如，SCCcap1携带1型荚膜基因簇，SCCfur携带夫西地酸耐药基因，SCCHg携带汞抗性操纵子。如果在SCC中没有发现这些推理功能的基因，那么就在命名SCC元件时在词尾加上菌株的名字，如，SCC476［14］。

此外，葡萄球菌中也包含SCC-相似区域，与SCC相似整合到ISS上并包含在ISS内，但是与SCC不同之处是不含有ccr基因。它们大小不同，从最小的(0.1 kb)到最大的(34 kb)，都以不同的方式被描述过，例如，SCC-相似元件，是一个分解代谢精氨酸的移动元件，一个染色体盒，或是一个SCCmec基因组插入位点序列［30］。建议称这些元件为假的SCC元件(ψSCC)。认为这些与SCC相似的ψSCC元件应该被指定在词尾增加基因的名字或是它们的功能或是加上菌株的名字来进行描述。在某些情况下，这些ψSCCs与SCCmec元件以串联的方式整合在一起，作为金黄色葡萄球菌的一个外源DNA簇基因组序列区域［20］。

7 结语

SCCmec盒式染色体是一种新型的可移动元件，大小为21～67 kbp，该元件主要包括mec基因复合体和染色体重组酶基因ccr复合体。根据mec和ccr基因复合体结构不同，可将SCCmec主要分为8种基因型。SCCmec可自主从染色体上切除，切除后形成的环状体，以适当方式转移到其他葡萄球菌菌株后，可再次重组到受体菌染色体中，使受体菌获得抗药性。SCCmec既可使耐药基因在菌株之间水平传播，也可使耐药基因叠加而使耐药谱扩大，从而使SCCmec型别具有高度多态性的同时不断有新的型别产生。SCCmec基因型与MRSA流行背景有关，也可能呈现地区性差异，不同的遗传背景的克隆株携带的SCCmec也可能不同，对SCCmec进行基因分型也可追踪其来源。

用适当的PCR技术为基础，鉴定SCCmec元件的型别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的流行病学特征和对SCCmec元件进行分类的研究具有重要的意义。

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