MTT法检测细菌细胞数的主要影响因素分析

吴窈画，谈书华，范超超，李正华

(江苏世泰实验器材有限公司暨南通市微生物学医疗器械工程技术中心，江苏海门226100)

1983年，Mosmann报告活细胞内的线粒体脱氢酶将MTT(四甲基偶氮唑盐，淡黄色)还原形成甲臜(Formazan，蓝紫色)的量与活细胞数成正比的活细胞分析方法，即MTT法［1］。该方法因具有敏感、快速和便捷的特点而被广泛用于生物活性因子的活性检测、大规模筛选抗肿瘤药物、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定［2-5］，以及微生物活菌计数［6-7］。微生物学用于细菌计数的常规方法有比浊法、分光光度计法和平板菌落计数法等［8］。前2种方法操作简单，只适于测定细菌总量。平板菌落计数法可检测活细菌细胞数，但方法繁琐、重复性差和检测周期较长。已经有一些将MTT法应用于细菌活细胞计数的报告，但是，缺乏对实施该方法的影响因素的系统研究。本课题对与MTT法定量检测4种病原细菌活细胞数有关的分析前培养时间、MTT还原反应时间、MTT量和针对反应产物的最适检测波长等进行了研究。同时发现经溶解和直接检测细胞内Formazan可以获得一致的分析结果。此外，应用本研究获得的各个实验参数建立的MTT法可以获得与平板菌落计数法一致的检测结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株由ATCC引进的实验菌株包括大肠埃希菌(Escherichia coli，ATCC 25922)、铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa，ATCC BAA-427)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，ATCC 6305)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC 25285)，分别代表需氧、兼性厌氧和厌氧细菌。

1.1.2 稀释液和培养基0.90%NaCl(pH 7.2)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA，含或不含5%羊血)、脑心浸液液体培养基(BHI)和脑心浸液琼脂(BHIA，含5%羊血)。

1.1.3 主要试剂5 mg/mL MTT溶液［6］(取100 mg MTT溶于20 mL pH 7.4的0.01 mol/L PBS缓冲液中，充分溶解后过滤除菌，4℃避光保存)、三联溶解液［9］(SDS 10 g，异丁醇5 mL，10 mol/L HCl 0.1 mL，用双蒸水配成100 mL溶液)。

1.2 方法

1.2.1 分析前培养时间测定将-70℃保存的E.coli菌种接种到TSA上37℃过夜培养。挑取平板上生长良好的单菌落接种到TSB中，37℃静止培养18～24 h。按1%接种量转接入50 mL新鲜的TSB中，37℃静止培养48 h，间隔一定时间取样1次。取测试样品100 μL于96孔细胞培养板中(重复3孔)，分别加入MTT溶液至终浓度0.5 mg/mL。同时设置空白对照，混匀后置于37℃，30 min后取出培养板，加入三联溶解液100 μL，充分溶解后测定OD578值［9］。对同一份样品同时进行平板菌落计数法测定［8］:对测试样品进行10倍梯度稀释，取各梯度菌液分别做活菌平板培养计数。

1.2.2 还原反应时间和MTT剂量分析取4种病原菌对数生长期的纯培养物(各菌株所用培养基及培养条件［10］如表1)，于适量0.90%NaCl中分别制成约3.0×109cfu/mL细菌悬液，连续3倍梯度稀释获6种浓度。取各浓度菌液100 μL于96孔细胞培养板中，每组9个平行，均分3组，分别加入MTT溶液至终浓度0.25、0.5和0.75 mg/mL。混匀后于合适条件下培养，间隔30、60、120、180、240、300 min取出培养板，加入100 μL三联溶解液充分溶解后测定OD578值。

表1 各标准菌株的培养条件Table 1 Incubation conditions for different ATCC strains

1.2.3 最适检测波长测定按1.2.2制备4种菌株的细菌悬液(约1.5×108cfu/mL)，分别取100 μL于96孔细胞培养板中(重复6孔)，加样孔中分别加入MTT溶液至终浓度0.25 mg/mL。同时设置空白对照，混匀后置于37℃，2 h后取出培养板，再加入三联溶解液100 μL。充分溶解后，依次测定530～630 nm的OD值。以测定波长为横坐标，相应OD值为纵坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收波长。

1.2.4 溶解和直接检测细胞内Formazan比较

按1.2.2制备E.coli细菌悬液(约3.0×109cfu/mL)，取制备好的菌悬液50、100、200、300和400 μL，分别补稀释液至1 mL，振荡混匀。按1.2.3加样，重复2块细胞培养板。MTT反应结束后，一块板孔中分别加入三联溶解液100 μL，充分溶解后测定OD578值;另一块于微型振荡器上充分振荡15 min后测定OD578值。

1.2.5 MTT法与平板菌落计数法比较按1.2.2制备4种菌株的细菌悬液(约1.5×108～3.0×109cfu/mL)，连续3倍梯度稀释获6种浓度。按1.2.4中直接检测法测定各浓度的OD578值，同一组分同时做活菌平板培养计数。

2 结果与分析

2.1 MTT法分析前培养时间检测

在细菌生长的各个阶段，MTT法与平板活菌计数法检测结果均表现出达到最大值后出现下降(图1)。

图1 2种不同方法测定E.coli的生长曲线Fig.1 The cell growth curve of E.coli measured by two different methods

2.2 还原反应时间对测定结果的影响

MTT=0.5 mg/mL时，在反应初期，肉眼可以观察到高浓度菌液即出现均匀的蓝紫色。反应30 min后，各浓度菌液的OD578已有明显梯度变化(图2)。随着反应时间的延长，OD578逐渐增加，2 h后变化趋缓，4～5 h后基本平稳(图3)。

图2 反应时间对测定结果的影响Fig.2 Effects of reaction time on the measuring results

图3 不同菌株测定结果随反应时间的变化情况Fig.3 Changes of the measuring results of different strains with reaction time

2.3 MTT量对测定结果的影响

图4 MTT量对测定结果的影响Fig.4 Effects of the MTT concentration on the measuring results

在相同浓度的活菌液中分别加入终浓度为0.25、0.5和0.75 mg/mL的MTT溶液，2 h后各浓度菌液OD578测定结果如图4所示。MTT=0.25 mg/mL时，对4种细菌均具有较好的线性关系(r=0.999 8)。

2.4 最适检测波长分析

4种细菌形成的Formazan在530～630 nm范围内的最大吸收峰均在560～580 nm处(图5)。

2.5 溶解和直接检测细胞内Formazan的比较

肉眼观察，在反应初期反应体系为均一的蓝紫色，静止一段时间后出现大量颗粒物聚集，经振荡后又重新分散均匀。显微镜下观察，菌体呈淡蓝色，内部有深蓝紫色圆形颗粒，加裂解液后菌体形态不清晰、蓝紫色颗粒变淡(图6)。对E.coli细胞形成的Formazan，分别采用直接检测与溶解后检测，结果经t检验无显著性差异(P＞0.05)(表2)。

图5 细菌菌体形成的Formazan光密度值随波长变化情况Fig.5 The variation of OD values of formazan with the wavelength

图6 MTT反应后的E.coli细胞(1 000×)Fig.6 Cells of E.coli after interaction with MTT(1 000×)

表2 MTT溶解与直接检测比较Table 2 Comparison between the dissolution and the direct test

2.6 MTT法检测的光密度值与平板活菌计数的比较

E.coli、P.aerugonisa、S.pneumonia和B.fragilis 4种病原菌菌浓度分别在2.13×107～1.60×109、1.33×107～5.67×108、1.00×106～1.17×108和2.40×107～3.67×109cfu/mL范围内时，MTT法检测的OD578与平板计数所得活菌数之间均具有较好的线性关系(r≥0.991 7，P＜0.05)(图7)。

图7 MTT法与平板菌落计数法的线性关系Fig.7 The liner relationship between the MTT assay and the plate colony counting method

3 讨论

本研究对MTT法用于定量分析细菌细胞数的主要影响因素进行了系统研究。基于4种细菌的代时相近，试验中以E.coli为代表菌对MTT分析前的培养时间进行了研究。测试结果显示Formazan生成量与细菌活细胞数呈正相关，对数生长期变化最为明显。细菌处于对数生长期和稳定期对MTT法的测定结果影响不大［6］，因此实验中均采用对数生长期的细胞进行研究。

本研究拓展了MTT法在原核细胞型微生物尤其是兼性厌氧和厌氧菌检测方面的应用。测试结果显示:4种细菌在其最适培养条件下均可还原MTT生成Formazan，表明微生物细胞利用MTT的现象具有普遍性。通过对还原反应时间、MTT量和最适检测波长的分析，获得了MTT法测定细菌细胞数的最佳条件:Formazan最大吸收波长为570～580 nm，MTT终浓度为0.25 mg/mL，反应时间为2 h。Formazan的生成量反映了细胞还原MTT能力的大小，实验中发现:不同微生物的相同细胞浓度对应的吸光值有区别，具体表现为其回归直线的斜率不同，说明不同微生物细胞还原MTT的能力存在差异。

MTT经还原生成的Formazan不溶于水，通常需要有机溶剂(如二甲基亚砜、异丁醇等)溶解后才能检测［4-7，9］。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且使用的有机溶剂对人体也有损害。本研究通过定性和定量的分析方法，验证了细菌形成的Formazan可以不使用裂解液。推测可能是微生物细胞与动物细胞在细胞结构和体外培养特点上的差异引起的:医学研究中广泛应用的动物细胞如成纤维细胞、上皮细胞等大多数真核细胞在体外培养时需要附着在固相表面才能生长;与真核细胞相比，微生物细胞个体微小、具有细胞壁、能耐受搅拌，容易悬浮形成均一的介质。

在以上研究基础上建立的MTT法，定量检测细菌细胞数浓度在107～109cfu/mL的测试结果与平板活菌计数具有较好的线性关系。因此，MTT法可以用于大部分细菌的活菌测定，简化操作过程的同时满足大批量样本的处理需求。

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