M-26碱性木聚糖酶的分离纯化及酶学性质研究

慕娟，问清江，李叶昕，党永

(陕西省微生物研究所，陕西西安710043)

木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，其中包括内切β-木聚糖酶和外切β-木聚糖酶，可以切割主链内部的糖苷键或从非还原端逐一切割单糖而将木聚糖水解，降解产物分别为低聚木糖或木糖［1］。关于木聚糖酶的研究起始于20世纪60年代，现在已知能够产生木聚糖酶的菌种包括细菌、真菌、霉菌等，不同来源的木聚糖酶的催化特性是有差异的［2］，有不同的最适pH和最适作用温度，可以应用于造纸工业、食品工业、饲料工业、制药工业等众多领域［3-6］。碱性木聚糖酶可以作为生物漂白剂应用于造纸工业，减少传统漂白工艺中氯用量，降低排污负荷，有利于环境保护，同时还可以改善纸张品质。已选育出的产碱性木聚糖酶的短小芽胞杆菌M-26，最高产酶活力可达625 IU/mL，具有良好的开发价值。为了更好地开发碱性木聚糖酶产品，从M-26发酵液分离纯化碱性木聚糖酶，并对其酶学性质进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种短小芽胞杆菌M-26。

1.1.2 试剂桦木木聚糖(brich wood xylan)，Sigma公司产品;3，5-二硝基水杨酸(DNS)，化学纯;sephadexG-25(国产);cellulose DE-52(Sigma公司);其他试剂为市售分析纯。

1.1.3 仪器层析柱:1.5 cm×10 cm，1.5 cm×30 cm;GL-20M冷冻离心机(上海);BYY-10C电泳仪(北京);752紫外分光光度仪(上海);722分光光度仪(上海);LGJ-冷冻干燥机(河南)。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制备M-26发酵液4 000 r/min低温离心15 min，收集上清液为粗酶液。

1.2.2 (NH4)2SO4盐析用量的确定分别取10 mL上清液，加入(NH4)2SO4至饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，充分混合均匀;4℃，放置过夜;4℃，4 000 r/min离心15 min，收集沉淀，测定沉淀的酶活和蛋白含量。计算木聚糖酶的收率和比活，并由此来确定最适盐析(NH4)2SO4的用量。

1.2.3 sephadexG-25脱盐取固体酶制剂0.1 g溶于2 mL无离子水中，4 000 r/min离心5 min，取上清液作为上柱样品，上样到sephadexG-25柱(1.5 cm×30 cm)中。用无离子水洗脱，流速为1 mL/min，每管收集5 mL。对各收集管测定木聚糖酶酶活和蛋白含量，根据酶活高低及比活收集并浓缩。

1.2.4 cellulose DE-52离子交换层析将sephadexG-25脱盐得到的酶样品加样到cellulose DE-52(1.5 cm×10 cm)柱中。以含有不同浓度(0.2～1.0 mol/L)NaCl的pH 7.6的Tris-HCl溶液进行梯度洗脱，流速为1 mL/min，每管收集5 mL。对各收集管测定木聚糖酶酶活和蛋白含量，根据酶活高低及比活收集并浓缩。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量配制15%的分离胶，6%的浓缩胶，用制胶槽制胶。将蛋白质样品与2×电泳缓冲液以1∶1混匀，沸水浴5 min，冷却，上样，上样量为7 μL，电泳160 V，1 h。

1.2.6 酶学性质分析①木聚糖酶反应的最适pH:用不同pH值的缓冲液适当稀释酶液，使酶反应在不同pH值条件下进行，测定酶活力;②木聚糖酶反应的最适温度:适当稀释酶液，分别在45、50、55、60、65℃温度条件下进行，测定酶活力;③pH对木聚糖酶稳定性的影响:分别用pH 7.6、8.0、8.6、9.0、9.6的缓冲液适当稀释酶液，4℃，放置24 h，测定其残余酶活力;④温度对木聚糖酶稳定性的影响:酶液分别在50、55、60、65、70℃下放置1 h，并每隔10 min取样，测定其残余酶活力。

1.2.7 金属离子对M-26碱性木聚糖酶活力的影响在适当稀释的酶液中加入浓度分别为5 mmol/L的Fe2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Al3+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+，测定其酶活。

1.2.8 木聚糖酶活力测定采用DNS法测定木聚糖酶活力。配制1 mg/mL木糖标准溶液，分别量取0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mL木糖标准溶液，用蒸馏水补齐1 mL，再加入2 mL DNS，沸水浴2 min，流水冷却后加蒸馏水至10 mL，在540 nm进行光吸收测定，绘制木糖标准曲线，得出回归方程用于酶活测定。发酵液经4 000 r/min离心15 min后取上清液，即为粗酶液。将粗酶液经适当稀释后，取0.5 mL酶液加入0.5 mL 1%的木聚糖溶液，50℃准确反应10 min，加入2 mL DNS终止反应，煮沸2 min显色，然后流水冷却至室温，定容至10 mL，以蒸馏水为对照，540 nm测定吸光值，根据回归方程得出水解液中木糖含量，从而确定酶活。酶活单位定义:上述条件下，每分钟释放1 μmol还原糖(以木糖计)所需要的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

2 结果与分析

2.1 (NH4)2SO4盐析用量的确定及M-26碱性木聚糖酶制剂的制备

如图1所示，当(NH4)2SO4的饱和度为50%时，酶的蛋白含量和酶活均较高，所以取此饱和度为最适酶蛋白盐析的硫酸铵溶液饱和度。用硫酸铵盐析制备碱性木聚糖酶，硫酸铵溶液的最适饱和度为50%;采用冷冻干燥法进行酶的干燥，酶的回收率为85%以上;由表1、表2可知，基础产酶条件下，酶制剂中活力为7 000 IU/g，经过碳源、氮源、金属离子等产酶培养基研究，生长曲线、接种龄、发酵时间等发酵条件研究后，酶制剂中活力提高为9 500 IU/g。

图1 M-26木聚糖酶盐析曲线Fig.1 The curve of M-26 xylanase salting out

表1 基础产酶条件制备酶制剂结果Table 1 The result of M-26 xylanase producing in basal medium

表2 优化产酶条件制备酶制剂结果Table 2 The result of M-26 xylanase producing in fermentation condition

2.2 sephadexG-25层析

将粗品酶液经sephadexG-25柱层析(见图2)，有一个主峰，此峰下的木聚糖酶活性高，将其收集合并冻干后用于下一步分离纯化用。

图2 M-26木聚糖酶sephadexG-25层析Fig.2 Chromatography of M-26 xylanase on SephadexG-25

2.3 cellulose DE-52离子交换层析

由图3可见，经cellulose DE-52离子交换层析后，有一个酶峰，将酶峰收集合并冻干。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量。木聚糖酶脱盐样品流经该柱，酶蛋白与cellulose DE-52的亲和力小于杂蛋白，首先被洗脱出来，如图3所示，第1个洗脱峰酶活力最高，因此该峰为碱性木聚糖酶蛋白峰，而杂蛋白的亲和力比碱性木聚糖酶蛋白强而被紧密吸附，从而分离出木聚糖酶，达到纯化目的。

图3 M-26木聚糖酶cellulose DE-52层析Fig.3 Chromatography of M-26 xylanase on cellulose DE-52

2.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量和蛋白纯度

用SDS-PAGE检测纯化过程中蛋白质的变化情况及纯度。如图4，随着纯化的进行，酶样品中杂蛋白逐步被去除，经过cellulose DE-52，蛋白质基本达到电泳纯。分子量范围在21.0～20.9 ku之间。存在2条蛋白带，主带接近20.1 ku，次带接近29.0 ku。2个蛋白条带，次带是否为主带蛋白的亚基，还有待进一步研究。

图4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.4 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

2.5 M-26碱性木聚糖酶的分离纯化结果

木聚糖酶的分离纯化如表3所示，sephadexG-25脱盐后，酶的比活为75.77 IU/mg蛋白，纯化倍数为11.93，酶的回收率36.33%;再经cellulose DE-52离子交换层析后，酶的比活为126.32 IU/mg蛋白，纯化倍数为19.89，酶的回收率12.83%;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量，分子量约为20 000多。

表3 木聚糖酶分离纯化结果Table 3 The result of M-26 xylanase purification

2.6 M-26碱性木聚糖酶的酶学性质

2.6.1 M-26碱性木聚糖酶最适作用温度及温度稳定性在不同温度条件下进行酶促反应，检测木聚糖酶活力，结果见图5。由图5可知，木聚糖酶的最适反应温度为55℃。将酶液在不同温度条件下保温20 min，检测剩余木聚糖酶活力，未经处理酶活力为100，结果见图6。50℃处理剩余酶活达95%以上，55℃处理剩余酶活为80%，60℃处理剩余酶活70%，65℃和70℃剩余酶活均为10%，说明此碱性木聚糖酶在60℃以下比较稳定。

图5 木聚糖酶的最适温度Fig.5 Effect of temperature on the activity of xylanase

图6 木聚糖酶的温度稳定性Fig.6 Temperature stability of xylanase

2.6.2 M-26碱性木聚糖酶最适作用pH及pH稳定性在不同pH值条件下进行酶促反应，测定酶活力，结果见图7，木聚糖酶的最适反应pH为8.0。将粗酶液用不同pH缓冲液适当稀释，4℃，放置24 h，测定其残余酶活力。结果见图8，酶液于pH 8.0下，几乎没有酶活损失;在pH 8.6下的残余酶活力约50%;在pH 9.0下，残余酶活力约40%;pH 9.6下，残余酶活力不足10%;结果表明该木聚糖酶为碱性木聚糖酶，且具有一定的耐碱性。

图7 木聚糖酶的最适作用pHFig.7 Effect of pH on the activity of xylanase

图8 木聚糖酶的pH稳定性Fig.8 pH stability of xylanase

2.7 金属离子对M-26碱性木聚糖酶活力的影响

不同金属离子对木聚糖酶活性影响见表4，Fe2+对该酶有激活作用;Mg2+、Ca2+、Ba2+和Al3+对该酶的活性基本无影响;Mn2+对该酶的抑制力接近50%;Zn2+、Fe3+、Cu2+具有强烈抑制作用。

2.8 不同底物的专一性

将纯化的碱性木聚糖酶加入到不同的底物中考察其底物专一性，由表5可知，经过纯化的木聚糖酶对可溶性淀粉、CMC、纤维素均基本无亲活力;而在用燕麦木聚糖和桦木木聚糖做底物时，该酶均具有较高的亲活力，燕麦木聚糖这一组酶活性更高，说明M-26碱性木聚糖酶对燕麦木聚糖的亲活力高于对桦木木聚糖的亲活力，这一点正和分离菌种的样品来源于造纸厂相吻合。

表4 金属离子对M-26碱性木聚糖酶活的影响Table 4 Effect of metallic ion on M-26 xylanase activity

表5 M-26碱性木聚糖酶的底物专一性Table 5 Substrate specificity of M-26 xylanase

3 讨论

从短小芽胞杆菌M-26的发酵液中分离纯化的碱性木聚糖酶，无纤维素酶活性，用于纸浆预处理不会破坏纤维素，有益于纸浆生物漂白的应用。工业用M-26碱性木聚糖酶制剂制备工艺中盐析硫酸铵的饱和度为50%，回收率为85%以上，成品酶活力可达9 000 IU/g。sephadexG-25脱盐，纯化倍数为11.93，酶的比活为75.77 IU/mg蛋白，回收率为36.33%;cellulose DE-52离子交换层析，纯化倍数为19.89，酶的比活为126.32 IU/mg，回收率为36.33%;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量约20.1～29 ku，主蛋白分子量20 100，次蛋白分子量29 000。酶的性质研究表明，酶作用的最适pH和温度分别为8.0和55℃，在60℃以下比较稳定，具有一定的耐碱性，纸浆生物漂白应用条件试验中的最适pH为9.6足以说明，因此短小芽胞杆菌M-26碱性木聚糖酶具有较好的开发潜力和应用前景。

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