＊ 三株桃小食心虫病原真菌的分离及形态鉴定

朱永敏,李捷,熊琦,谢映平,薛皎亮

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西省农业科学院植物保护研究所,山西太原 030031)

＊三株桃小食心虫病原真菌的分离及形态鉴定

朱永敏1,李捷2,熊琦1,谢映平1,薛皎亮1＊

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西省农业科学院植物保护研究所,山西太原 030031)

从山西襄汾苹果园越冬的桃小食心虫(Carposina sasakiiMatsmura)采集获得自然染病的虫体,经分离纯化得到三株病原真菌,编号分别为 TSL01、TSL02、TSL03,通过回接试验证明这3株菌株为桃小食心虫的病原菌.根据培养性状和显微形态观察发现:3株菌株在PDA培养基上均为白色,菌株 TSL 01和 TSL03菌落大,可产生黄褐色或淡紫色色素.它们都产生两种类型的分生孢子,大型分生孢子,月牙形或镰刀形,有隔;小型分生孢子,椭圆形,肾形或卵圆形,假头状着生,菌丝透明有隔,轮状生长;菌株 TSL02菌落较小,后期产生黄色色素,分生孢子圆柱形至梭形,串生,分生孢子梗呈“Y”形.初步鉴定菌株 TSL01与菌株 TSL03为镰孢菌属(Fusarium)尖孢镰孢菌(F.oxysporum),菌株TSL02为拟青霉属(Paecilom yces)粉质拟青霉(P.farinosus).这是在桃小食心虫上首次记录该两类病原菌.

桃小食心虫;病原真菌;形态鉴定

桃小食心虫(Carposina sasakiiM atsm ura),简称桃小,隶属鳞翅目Lepidop tera、蛀果蛾科Carposinldae,是我国北方果树生产中发生面积最普遍、危害最大的食心虫类害虫,可危害苹果、枣、梨、桃、杏等十多种果树的果实[1].目前桃小食心虫的防治仍以化学杀虫剂为主,化学杀虫剂虽具有见效快、成本低的优点,但常年用药防治次数过多,不仅使害虫产生抗药性,还会污染环境、杀死天敌、农药残留,对果品安全构成极大威胁,大力推行和普及生物防治技术成为当前全球果树栽培发展的总趋势.

利用昆虫病原真菌防治害虫是生物防治的重要手段,虫生真菌种类多,具有显著的流行趋势,容易大量生产,且安全有效,在害虫生物防治中占有越来越重要的地位.目前关于病原真菌防治桃小食心虫的报道较少,陶训等[2-3]利用白僵菌防治桃小食心虫,研究了白僵菌寄生桃小食心虫的生物学特性以及白僵菌与化学杀虫剂对硫磷微胶囊混用防治桃小食心虫的室内和田间试验,证明了对桃小食心虫有很好的防治效果;樊美珍等[4]调查研究了金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)分生孢子和干菌丝在土壤中的延续情况及对桃小食心虫的侵染力,证实绿僵菌控制桃小食心虫有很好的潜力.

本研究从桃小食心虫越冬茧的自然染病虫尸上分离纯化得到3株侵染桃小食心虫的病原真菌,经室内培养和显微形态特征的鉴定,其中两菌株为镰孢属(Fusarium)尖孢镰孢菌(F.oxysporum),另外一种为拟青霉属(Paecilomyces)粉质拟青霉(P.farinosus),希望能为利用昆虫病原菌防治桃小食心虫提供菌种资源和应用依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 桃小食心虫自然染病虫尸

2009年3月自山西省襄汾县景毛乡苹果园受虫害严重果树下表土层里采集到自然染病的桃小食心虫越冬茧,从茧中将染病的幼虫剥出,用来培养和分离菌种.

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)[成分及配比:马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖18 g、蒸馏水1 000 m L]

1.1.3 回接试验的虫源

用健康的桃小食心虫幼虫作为回接试验昆虫,2009年9月采集被桃小食心虫钻蛀的枣和苹果,放置于室内,让桃小食心虫幼虫自然脱果,收集健康虫体,用于试验.

1.1.4 仪器和药品

主要仪器:OL YMPUS BX51显微镜及配套的OL YMPUS数码相机C-5050 Zoom;DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司);ZDX-35BI座式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);CJ-C系列洁净工作台 (上海上净实业有限公司).

主要试剂:琼脂(北京奥博星生物技术责任有限公司);葡萄糖(天津市博迪化工有限公司);Tween-80(天津市化学试剂三厂).

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分离和纯化

在无菌条件下将受真菌感染的桃小食心虫虫尸,每头剪成3小块,用70%的酒精浸5 s,再用0.1%汞水消毒3 m in,然后用无菌水冲洗3次,再将虫尸小块放入PDA平板培养基中,每一个培养皿内放3块,呈等腰三角形摆放.把装有虫尸的培养皿置于培养室,在25℃下培养3 d,再将培养出的菌株划线分离.

1.2.2 菌株培养与形态观察

将3株纯化菌株分别点接于PDA平板培养基上,25℃恒温培养室培养4 d或5 d,观察记录菌落特征,测量菌落直径.用载片观察法[5]观察菌株形态特征,记录分生孢子大小、形状、着生方式及菌丝形态特点.

将圆形滤纸铺于培养皿的底部,再放一“U”形玻棒,棒上放一洁净载玻片,盖上皿盖,灭菌后烘干备用.用无菌玻棒直接蘸取已融化的培养基滴于培养皿的载玻片中央.待培养基凝固后用接种环取少量孢子接种于载玻片上培养基小块的四周,加上盖玻片.为防止培养过程中培养基干燥,在培养皿的滤纸圆片上滴加无菌的饱和氯化钠溶液3～4 m L,盖好皿盖,置25℃的培养箱中培养,定期取出,观察显微结构并拍照.

1.2.3 菌种鉴定

根据形态学观察,参照《山西虫生真菌》[6]以及蒲蛰龙《昆虫真菌学》[7]来鉴定分离的病原真菌.

1.2.4 孢子悬浮液的制备

将3株病原真菌接种于PDA平板,在70%湿度、25℃恒温箱中培养10 d,然后用0.5%Tween-80溶液洗脱分生孢子,在显微镜下以血球计数板计数,检测分生孢子浓度,并将其配置成孢子浓度为5×107m L的悬浮液,为回接试验使用.

1.2.5 回接试验

将上述制备成的3株病原真菌孢子悬浮液(孢子浓度5×107个/mL),用移液枪将孢子悬液喷洒到桃小食心虫幼虫体表,每头幼虫喷洒10μL,将接菌后的幼虫放在玻璃养虫缸内,置于25℃、湿度70%的培养室内培养,逐天观察染菌后的幼虫的行为、死亡后的症状、虫体表面菌丝和孢子的形态特征,以确定该菌是否为侵染桃小食心虫的致病菌.

2 结果与分析

2.1 自然罹病虫尸症状

2009年3月在山西省襄汾县景毛乡苹果里采集的桃小食心虫越冬茧剥开后发现有几头桃小虫尸上有虫生真菌寄生现象,虫体表面均有白色菌丝(图1),虫体僵硬,其中一头僵虫虫体发黄,有黑色斑点(图1A),一头虫尸为石灰色(图1B),另外一头僵虫虫体发黄(图1C).

2.2 菌株分离结果

经划线分离纯化得到桃小食心虫的3株病原真菌,分别编号为 TSL 01、TSL 02、TSL03.

2.3 回接杀虫试验结果

图1 从山西省襄汾县苹果园采集的自然罹病桃小食心虫Fig.1 Carposina sasakii larvae infected by the entomopathogenic fungus from the soil of the apple orchard at Xiangfen,Shanxi

为了验证分离得到的3株菌株就是致死桃小食心虫的病原菌,用上述菌株的孢子悬液(浓度:5×107孢子/m L)分别感染健康的桃小食心虫.结果发现,被菌株 TSL 01感染的桃小食心虫3 d后开始相继死亡,保湿培养后从虫体内长出白色菌丝,虫体的体色发黄,逐渐萎缩干瘪(图2A);被菌株 TSL02感染的桃小食心虫4 d后开始相继死亡,死亡时虫体全身颜色变暗,最后黑紫(图2B),保湿培养虫体长出白色菌丝;被菌株TSL 03感染的桃小食心虫5 d后开始相继死亡,保湿培养后从虫体内长出白色菌丝(图2C).在显微镜下观察对比菌丝和孢子的形态特征,其与开始从桃小食心虫僵尸上分离纯化的3株菌株相同.由此证明,从桃小食心虫上分离得到的3株菌株是桃小食心虫的致病菌.

图2 桃小食心虫幼虫被分离菌株感染的症状,A:被菌株TSL01感染症状;B:被菌株 TSL02感染症状;C:被菌株 TSL03感染症状.Fig.2 Symp tom of Carposinasasakii larvae infected by the isolated strains of fungi,A:infected by the strain TSL01,B:infected by the strain TSL02 and C:infected by the strain TSL03.

2.4 形态特征

2.4.1 菌株 TSL01

培养性状:菌株在PDA培养基上25℃培养4 d,菌落较大,直径40～42 mm,不透明,白色,呈圆形或扁圆形,中央隆起呈帽状结构,边缘丝状,较稀疏,向四周呈辐射状分散(图3A),气生菌丝白色,丝绒状、羊毛状至毡状.菌落背面呈淡黄褐色,中央为深黄褐色(图3B).

形态特征(图3C):分生孢子既有大型分生孢子又有小型分生孢子,大型者数量较多,月牙形,较匀称,3-5分隔,多数3分隔,大小为(18.0～34.0)μm×(3.3～4.7)μm;小型者椭圆形、肾形、卵圆形,假头状着生,大小为(5.3～12.0)μm×(2.0～3.3)μm;产孢细胞单瓶梗.菌丝透明有隔,轮状生长.

经鉴定,菌株 TSL 01为镰孢属尖孢镰孢.

2.4.2 菌株 TSL 02

培养性状:菌株在PDA培养基上25℃培养4 d,菌落直径18～20 mm,菌落小,白色,不透明,呈圆形或扁圆形,菌落隆起,成帽状,表面菌丝致密;菌落边缘整齐(图4A).菌落背面初期为白色(图4B),后期发黄.

形态特征:分生孢子梗产自气生菌丝,光滑透明有分隔;分生孢子梗常为轮生状小梗,具有几乎圆柱状基部和1-3个圆锥状顶部,多呈“Y”字形状.分生孢子从圆柱形至梭形,单孢,光滑,大小为(2.0～2.9)μm×(1.5～2.2)μm;分生孢子常连接成近于直立的长链,其很少缠结(图4C).分生孢子萌发前膨胀,并伸长,产生1芽管.

经鉴定,菌株 TSL 02为拟青霉属粉质拟青霉.

图3 TSL01菌株培养性状与形态特征,A:菌落正面观,B:菌落背面观,C:菌株显微结构.Fig.3 Cultural and morphological characteristics of the strain TSL01,A:The front view of colony,B:The back view of colony,C:Micro-structure of the strain.

图4 菌株 TSL02培养性状与形态特征,A:菌落正面观,B:菌落背面观,C:菌株显微结构Fig.4 Cultural and morphological characteristics of the strain TSL02,A:The front view of colony,B:The back view of colony,C:Micro-structure of the strain.

2.4.3 菌株 TSL03

培养性状:菌株在PDA培养基上25℃培养5 d,菌落直径42～47 mm,菌落较大,不透明,呈圆形或扁圆形,中央为脐状凸起状,菌落边缘为丝状,较稀疏,呈辐射状,边缘较扁平(图5A).菌落背面淡紫色,边缘白色(图5B).气生菌丝白色,生长后期偶有些菌丝为淡紫色,菌丝呈丝绒状、羊毛状至毡状.

形态特征:分生孢子既有大型分生孢子,又有小型分生孢子,小型孢子量多,大型孢子量很少.小型分生孢子椭圆形、肾形、卵圆形,单生,串生或假头生,0-1个分隔,孢子中央凹陷,呈血细胞状,大小为(4.8～17.6)μm×(2.4～4)μm;大型分生孢子纺锤形,或稍弯呈镰刀形,也凹陷,3-5分隔,一般3个分隔,大小为(30～36)μm×(3.6～4.4)μm;菌丝有隔,每个隔之间一个孢子梗,孢子梗轮生.

经鉴定,菌株 TSL 03为镰孢属尖孢镰孢.

图5 菌株 TSL03培养性状与形态特征,A:菌落正面观,B:菌落背面观,C:菌株显微结构显示小型分生孢子,D:菌株显微结构显示大型分生孢子Fig.5 Cultural and morphological characteristics of the strain TSL03,A:The front view of colony,B:The back view of colony,C:Micro-structure of the strain showing the small conidia,D:Micro-structure of the strain showing the big conidia.

3 讨论

本研究从自然染病的桃小食心虫虫尸上分离纯化出3株虫生真菌,鉴定结果显示菌株 TSL01和菌株TSL 03属于镰孢属尖孢镰孢菌,菌株 TSL02属于拟青霉属粉质拟青霉.回接试验证明它们对桃小食心虫具有寄生致死作用,是桃小食心虫病原菌.

虫生镰刀菌属于(镰孢属)一类重要昆虫病原真菌,对其研究始于Webber在1897年对寄生在介壳虫上镰刀菌的描述.在南美、北美和南亚国家记录的有F.coccophilum、F.merismoides、F.larvarum、F.episphaeria、F.stilboides等[8].美国佛罗里达州利用F.coccophilum防治桃树和柑桔的蚧虫取得了显著效果[9].国内曾报道过嗜蚧镰刀菌(F.coccophilum)等10种镰刀菌可寄生蚧虫,并对控制蚧虫种群数量具有重要作用[10].Sundar等从雌性Culexquinquefasciatus分离出F.pallidoroseum,并发现这株镰刀菌对寄主蚊子在7 d的致死率达100%,具有很好的杀虫效果[11].串珠镰刀菌(F.moniliforme)和燕麦镰刀菌(F.avenaceum)可寄生鳞翅目、同翅目、双翅目中的许多害虫,对幼虫的寄生致死率50%～100%[12].

拟青霉在自然界中分布广泛,也是国内外主要研究和利用的虫生真菌类群.迄今为止,我国有记载的拟青霉属虫生真菌共有16个种或变种[13],研究报道最多的是淡紫拟青霉(P.lilacinus)、粉质拟青霉(P.farinosus)和玫烟色拟青霉(P.fumosoroseus).国内外利用淡紫拟青霉主要用于防治线虫,有近70个国家用它来防治根结线虫(Meloidogynespp.)、胞囊线虫(Heteroderasp.)等植物寄生线虫,并取得了较好的效果[14].武觐文利用粉质拟青霉菌剂防治越冬油松毛虫致死率约为70%[15].玫烟色拟青霉防治害虫的报道主要有用其防治蚜虫、烟粉虱、朱砂叶螨和菜青虫等害虫[16-19],也有报道利用拟青霉防治小菜娥[20-21].

以上报道可以看出,国内外利用镰刀菌属和拟青霉属防治害虫均有很好的效果.根据现有记载,鲜见有从桃小食心虫上分离出镰孢属病原菌的报道.日本在1994年从桃小食心虫上曾分离出玫烟色拟青霉[22],但我国还没有从桃小食心虫上分离出拟青霉的报道.因此,本研究分离的3个菌株为开展桃小食心虫生物防治提供了新的菌种资源,但为了更好地利用这些菌种,应对这些菌株进行超微结构观察和遗传分子鉴定是必要的.同时,还应该研究它们的生物学特性和对寄主昆虫的毒力,为菌株进一步开发提供科学依据.

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Isolation and Morphological Identification of Three Strains of Entomopathogenic Fungi of Carposina sasakii

ZHU Yong-min1,LI Jie2,XIONG Qi1,XIE Ying-ping1,XUE Jiao-liang1
(1.School of life Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China;
2.Institute of Plant Protection,Shanxi Academy of Agriculture Sciences,Taiyuan030031,China)

Three strains of entomopathogenic fungi designated No.TSL01,No.TSL02 and No.TSL03 were isolated from the natural infected insect,Carposina sasakii(Matsmura)at the apple orchard in Xiangfen,Shanxi,China.These strains were identified as pathogens ofC.sasakiiby reinoculation test,moreover,the cultural and morphological characteristics w ere observed.The results show ed that the m ycelium of three strainswasw hite.Both of the two strains,TSL 01 and TSL 03,had big colonies and could secrete snuffcolored or orchid pigment.Two kinds of conidiophores can be produced from them.The macroconidia was crescent or falciform with separators,w hile the microconidia was oblong,or kidney-shaped and grow s as cephalosporium,and their hyphae also possessed separato rs.The colony of the strain TSL 02 w as relatively small and the pigment was unconspicuous.Its conidiophores,columniform or spindly,arranged in a chain,and the peduncle of the conidiopho res p resented in a“Y”shape.These characteristics indicated that the strain TSL01 and TSL 03 were belong to the genusFusarium oxysporum,and the strain TSL 02 was belong to the genusPaecilomyces farinosus.This is the first record on these kinds of the entomopathogenic fungi fromC.sasakii.

Carposina sasakii(Matsmura);entomopathogenic fungi;morphological identification

S763.42;Q969.42+9.5

A

0253-2395(2011)01-0131-06＊

2010-04-12;

2010-07-16

农业公益性行业科研专项(200803006)

朱永敏(1984-),女,山西临汾人,硕士研究生,主要研究昆虫病原真菌与生物防治.E-mail:zhuyongmin11@126.com＊通讯作者:E-mail:xuejl@sxu.edu.cn