＊ Cu(Ⅱ)与 EHPG作用的光谱研究

章丽萍,韩樱,杨斌盛

(山西大学分子科学研究所,山西太原 030006)

＊Cu(Ⅱ)与 EHPG作用的光谱研究

章丽萍,韩樱,杨斌盛

(山西大学分子科学研究所,山西太原 030006)

在p H 6.0,200 mmol/L磷酸盐缓冲溶液中使用紫外差光谱、荧光光谱研究了Cu(II)与N,N‘-乙烯-二[2-(2-羟基苯基)苷氨酸](EHPG)的结合.结果表明Cu(II)可与EHPG形成1∶1的稳定配合物,其在265 nm处的摩尔吸光度为(5.462±0.035)×104cm-1·mol-1·L.配合物条件结合常数为:logKCu-EHPG=15.62±0.18.

铜(II);EHPG;荧光光谱;紫外差光谱

铜是从原核生物到真核生物所有生命体赖以生存所必需的微量元素.铜特有的氧化还原性质(氧化态Cu2+还原态Cu+)使其成为生物体内许多金属蛋白、酶(如细胞色素c氧化酶、酪氨酸酶、Cu,Zn超氧化歧化酶等)的辅因子而参与许多生化过程.同时,由于细胞内游离铜能够催化羟基自由基产生而使铜又具有潜在的细胞毒性.此外,游离铜离子可以随机结合到生物分子的功能基团上,从而影响功能基团发挥正确的生物功能.因此,生物体系拥有独特的铜稳态调节机制,以保证细胞内含有适量的营养元素铜而将其对细胞的毒性降至最低.不引起细胞中毒的游离铜离子浓度应不高于10-18mol·L-1[1-3].细胞内非常低的游离金属离子浓度测定是生命金属调控研究中面临的重要课题[4].

N,N′-乙烯-二[2-(2-羟基苯基)苷氨酸](EHPG)(图1)既具有丰富的光谱性质,又具有可与金属离子结合的羧基、氨基、酚羟基,可用于模拟金属离子与蛋白质的结合[5-8].本文利用光谱方法研究了生理条件下Cu(Ⅱ)与 EHPG的结合.

图1 EHPG分子结构Fig 1 Molecular structure of EHPG

1 实验部分

1.1 材料与仪器

乙二氨四乙酸(EDTA),氯化铜,分析纯,北京化学试剂厂;N,N′-乙烯-二[2-(2-羟基苯基)苷氨酸](EHPG)(Sigma公司).其它试剂均为分析纯.

HP8453UV-Vis吸收光谱仪、F-2500荧光光谱仪、Beckman酸度计、Eppendorf移液枪.

1.2 光谱测定

紫外光谱使用 HP8453紫外-可见吸收光谱仪测定;荧光光谱在F-2500荧光光谱仪上测定,激发狭缝和发射狭缝均为10 nm.测定均在室温条件下用1 cm光谱池.

实验中所有的玻璃仪器以及光谱池均使用1.0 mol/L HNO3浸泡后用蒸馏水冲洗干净.

2 结果与讨论

2.1 EHPG与Cu(Ⅱ)结合的紫外差光谱

室温,p H 6.0,200 mmol/L磷酸盐缓冲溶液条件下,2 m L浓度为6.0×10-4mol/L的EHPG的紫外差光谱如图2曲线a.用1×10-3mol/L Cu2+溶液逐渐滴定之,其紫外差光谱如图2曲线(b-j)所示.由图2可见,Cu2+的滴加使EHPG的紫外差光谱在236 nm和290 nm处产生两个吸收峰.随着Cu2+的滴加,236 nm和290 nm处的吸收峰逐渐增加并最终停滞于最大值.

图2 Cu(II)滴定 EHPG的紫外差光谱Fig 2 Difference UV spectra produced by the addition of Cu(II)to EHPG

236 nm和290 nm处的吸收峰可归因于 EHPG与Cu2+结合时酚羟基参与配位,影响芳环的π-π＊跃迁而产生的.将265 nm处吸光度被 EHPG的分析浓度除,得出 EHPG与Cu2+结合的表观摩尔吸光度(Absorptivity),并将265 nm处的Absorptivity对Cu(II)与 EHPG的摩尔比作图(图3).由图3可见,滴定曲线在初始阶段Absorptivity随Cu(II)与EHPG摩尔比呈线性增加,至Cu(II)与 EHPG摩尔比为1附近出现明显的拐点.表明在室温,p H 6.0,200 mmol/L磷酸盐缓冲溶液条件下Cu(II)与 EHPG形成1∶1的稳定配合物.在265 nm处Cu(II)-EHPG配合物的摩尔吸光度为(5.462±0.035)×104cm-1·mol-1·L.

图3 Cu(II)对EHPG的紫外差光谱滴定曲线Fig 3 Titration curve for the addition of Cu2+to EHPG from difference UV spectra

2.2 EHPG与Cu(Ⅱ)结合的荧光光谱

图4a为室温,p H 6.0,200 mmol/L磷酸盐缓冲溶液中1×10-5mol/L EHPG的荧光光谱,可见EHPG在304 nm处出现最大荧光峰.当用1×10-4mol/L Cu2+溶液滴定上述溶液时,最大荧光峰位没有明显变化,荧光强度逐渐减弱,如图4(b-g)所示.当Cu2+达到一定量后,EHPG在304 nm处的荧光强度不再随着Cu2+的滴加而变化,如图4(g-h)所示.表明Cu(II)与 EHPG结合使其在304 nm处的荧光被淬灭.

图4 Cu(II)滴定 EHPG的荧光光谱Fig 4 Fluorescence spectra produced by the addition of Cu(II)to EHPG

图5 Cu(II)对 EHPG的荧光滴定曲线Fig 5 Titration curves for the addition of Cu2+in different[EDTA]t/[Cu(Ⅱ)]t to EHPG from fluorescence spectra

为了便于不同滴定数据的对比以及消除每次滴定所引起的稀释效应,将304 nm处的荧光强度除以EHPG的分析浓度转化为表观摩尔荧光强度(F).以表观摩尔荧光强度(F)对Cu(Ⅱ)与EHPG的摩尔比作图,结果如图5a所示.由图5a可见,滴定曲线初始部分的表观摩尔荧光强度线性降低,意味着滴加的Cu(Ⅱ)与EHPG完全结合.当Cu(Ⅱ)与EHPG的摩尔比等于1.0时,滴定曲线出现明显的拐点,同样表明Cu(Ⅱ)与EHPG形成1∶1的稳定配合物.

2.3 EHPG与Cu(Ⅱ)的条件结合常数

由紫外差光谱和荧光光谱滴定可见,Cu(Ⅱ)与EHPG间有如下反应:

由于EDTA、配合物Cu(Ⅱ)-EDTA于304 nm处没有荧光,即滴定剂中引入竞争配体EDTA并不影响EHPG的光谱特征.滴定中使用 EDTA为竞争配体,用已知 ED TA与Cu(Ⅱ)摩尔比的溶液滴定 EHPG,滴定曲线如图5b所示.由图5可见,滴定曲线初始部分斜率随 [EDTA]t/[Cu(Ⅱ)]t值的增大而减小.这是由于EDTA和 EHPG竞争性地结合Cu(Ⅱ),部分Cu(Ⅱ)与EDTA结合使观察到的Cu(Ⅱ)淬灭效应减小.设相同Cu(Ⅱ)浓度下,EDTA的引入导致摩尔荧光强度的增加完全源于Cu(Ⅱ)-EHPG配合物向Cu(Ⅱ)-EDTA配合物的转化,则根据图5及Cu(Ⅱ)、EHPG、ED TA间的物料平衡,不同滴定点的物种浓度可使用(1-5)式计算.

其中[Cu-EHPG]、[EHPG]f、[EHPG]t分别为Cu(Ⅱ)-EHPG配合物、游离 EHPG的浓度及 EHPG的总浓度;[Cu-EDTA]、[ED TA]f、[ED TA]t分别为Cu(Ⅱ)-ED TA配合物、游离 ED TA的浓度及 ED TA的总浓度;F(a,b)为测得的表观摩尔荧光强度,FEHPG为 EHPG的表观摩尔荧光强度,FCu-EHPG为Cu(Ⅱ)-EHPG配合物的摩尔荧光强度,αH为EDTA的酸效应系数,KCu-EDTA为Cu-EDTA配合物的稳定常数.

由配合物Cu(Ⅱ)-EDTA的稳定常数KCu-EDTA[9],根据(6)式可计算出Cu(Ⅱ)与EHPG结合的条件稳定常数:lgKCu-EHPG=15.62±0.18.

3 结论

在p H 6.0,200 mmol/L磷酸盐缓冲溶液中Cu(II)可与 EHPG形成1∶1的稳定配合物,其在265 nm处的摩尔吸光度为(5.462±0.035)×104cm-1·mol-1·L.Cu(II)与EHPG的结合使其在304 nm处荧光被淬灭达56%,以ED TA为竞争配体,由荧光淬灭可得Cu(II)-EHPG配合物条件结合常数为:lgKCu-EHPG=15.62±0.18.

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Spectral Studies on the Binding of Cupric Ion to EHPG

ZHANG Li-ping,HAN Ying,YANGBin-sheng
(Institute of Molecular Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China)

In 200 mmol/L phosphate buffer with p H6.0,the reaction of N,N’-ethylenebis[2-(o-hydroxyphenolic)glycine]with cupric ion was monitored by UV difference and fluorescence spectra.The molar absorptivity of Cu(II)-EHPG at 265 nm is(5.462 ±0.035)×104cm-1·mol-1·L.The conditional binding constant is logKCu-EHPG=15.62±0.18.

cupric ion;EHPG;Fluorescence;UV difference spectra

O657.1

A

0253-2395(2011)01-0114-04＊

2010-07-10;

2010-09-08

国家自然科学基金(20771068)

章丽萍(1964-),女,山西大同人,在读硕士生,大同卫校讲师,从事生物电化学研究.E-mail:lpzhang64@163.com