蛹虫草优良菌株的筛选

孙军德，宋思丹，王颖，房琳琳，白立红

(沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳110161)

北冬虫夏草(Cordyceps militaris(L.)Link)又叫蛹虫草或北虫草，属于子囊菌亚门，核菌纲，麦角菌目，麦角菌科，虫草属，是虫草属的一个模式菌种，它是寄生在夜蛾科等蛹体上，与冬虫夏草同属不同种［1］。蛹虫草是我国名贵中药材的一种，具有很高的食用和药用价值［2］。北虫草中的多糖、虫草素等成分具有增强免疫调节和抑制肿瘤的作用，经过科研人员多年的精心研究，蛹虫草的人工栽培已经达到工厂化的规模［3］。本试验通过对5株蛹虫草形态、生长速率、液体培养生物量和胞外多糖、人工栽培和蛹虫草子实体多糖、虫草素的对比研究，筛选出蛹虫草的优良菌株，为工业化的大量生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株蛹虫草1号、2号、6号、B1、K36采自沈阳棋盘山，由沈阳农业大学微生物教研室保存。

1.1.2 培养基①PDA加富培养基:马铃薯200g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.1g，加水至1 000 mL;②基础培养基:葡萄糖20 g，酵母粉2 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1 000 mL;③液体培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，MgSO43 g，加水至1 000 mL;④营养液:蛋白胨4.5 g，葡萄糖20 g，加水至1 000 mL;⑤栽培培养基:小麦30 g，自来水50 mL。马铃薯处理:去皮后称重，切块，水开后继续煮0.5 h，8层纱布过滤除渣。培养基灭菌条件:121℃，灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌落培养用直径5 mm的灭菌打孔器取蛹虫草菌片接种至PDA平板中央，将平板分别置于培养室自然光照培养，观察菌落形态。培养5 d后，每隔2 d测定菌落直径，计算不同蛹虫草菌株的生长速率［4］。

1.2.2 液体培养用无菌的打孔器取相同量的菌片置于液体培养基，摇瓶培养7 d后，4层纱布过滤，菌丝体60℃烘干至恒重后，测定不同菌株的生物量，收集滤液，测定胞外多糖含量。

1.2.3 人工栽培试验将活化后的蛹虫草菌片接入含有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，往复震荡培养7 d，静置1 d确保无杂菌后，用营养液稀释5倍即为栽培用液体菌种。在500 mL罐头瓶中装入30 g小麦和50 mL自来水，用聚丙烯塑料薄膜封口，常压灭菌24 h，过夜冷却，接入5 mL液体菌种，置发菌室，18℃黑暗条件下发菌7 d。待菌丝长满培养基后进行22℃光照转色，7 d后完成转色，在塑料封口膜上打孔进行出草管理。培养48 d后描述形态，采收并测量记录试验数据。

1.2.4 子实体活性物质含量的测定①多糖含量的测定:将蛹虫草子实体切成小块，置于烘箱内，40℃条件下烘干数小时，直至完全干燥。将干燥后的子实体小块放入电动粉碎机中粉碎成粉末状，称取蛹虫草粉末10.00 g，用95%的乙醇浸提3次后，将子实体晾干，挥发掉残存的乙醇溶剂，备用。用热水浸提法提取粗多糖，以除脂后的子实体干粉为材料，用热水提取子实体粗多糖，温度80℃，提取时间2 h，料液比1∶10，4层纱布过滤，滤液用浓度75%的乙醇沉淀，于4℃冰箱中放置12 h，3 000 r/min离心15 min，所得沉淀物经丙醇、无水乙醇洗涤后真空干燥，即为粗多糖，称重［5］;②虫草素含量的测定:将蛹虫草子实体切成小块，置于烘箱内，40℃条件下烘干数小时，直至完全干燥。将干燥后的子实体小块放入电动粉碎机中粉碎成粉末状。称取蛹虫草粉末5.00 g，加入25 mL 70%的乙醇，浸提8 h，震荡2 h，过滤，收集滤液。重复3次，合并滤液，真空干燥后，用5 mL的超纯水溶解，过滤后备用。采用高效液相法(HPLC)测定虫草素含量［6］:高效液相色谱仪:waters 1525 Binary HPLC Pump;检测器:waters2487 Dualλabsorbance Detector;流动相:甲醇∶超纯水=15∶85;检测波长:260 nm;流速:0.8 mL/min;保留时间:9.2 min。虫草素标准曲线方程:y=2E+08x+648 346，r=0.999 4

2 结果与分析

2.1 不同菌株菌丝生长试验结果

由表1可知，各菌株的菌丝在生长初期都十分缓慢，显示菌丝处于适应期，然后发现菌丝生长总势明显加快。总体来看，6号菌丝生长最快，菌落整齐，形态正常，转色比较好。其它的菌株都比6号菌株萌发迟缓、长势差，1号生长最为缓慢，长势最差，转色慢。

表1 不同菌株菌丝生长试验结果Table 1 Test results of different strains on mycelium growth

2.2 不同菌株液体培养试验结果

2.2.1 液体培养生物量的测定摇瓶培养7 d后，发现6号菌株的液体培养基透明，其中的菌球大小适当、均匀一致、丰富，菌丝球表面形成大量放射状的菌刺;1号菌株的培养基透明，但是菌球量较少。不同菌株的生物量试验结果见图1。由图1可知，6号菌株菌丝累积量最多，达到1.39 g/100 mL。说明6号菌株的液体培养中能累积大量的菌丝体，对工业生产有实际的经济价值。

图1 不同菌株菌丝体生物量试验结果Fig.1 Test results of different strains on mycelium biomass

2.2.2 液体培养胞外多糖含量的测定摇瓶培养7 d，过滤，收集滤液，用苯酚-硫酸法测定不同菌株的胞外多糖含量，试验结果见图2。由图2可知，6号菌株含量最高，可达到22.96 mg/mL。

图2 不同菌株菌丝体胞外多糖试验结果Fig.2 Test results of different strains on Exocellular polysaccharide

2.3 不同菌株的瓶栽试验结果

2.3.1 不同菌株子实体形态描述菌株1号子实体橙黄色，柄矮、粗，头部膨大呈球形，有子囊壳，部分头部发白;菌株2号子实体橘黄色，柄弯曲、较细，有子囊壳，长势密集;菌株6号子囊壳丰富，颜色橘黄，出草整齐均匀，出草率高，柄粗细均匀，出草疏密度适当;菌株B1子实体橘黄色，柄细、弯曲，小尖头;菌株K36子实体橙黄色，柄细、光滑，根部粗(图3)。

图3 不同菌株人工栽培的子实体形态Fig.3 The fruitbody morphology of different strains on artificial cultivation

2.3.2 不同菌株人工栽培试验结果接入液体菌种后置发菌室18℃黑暗发菌，发菌时，菌丝雪白，絮状，较稀疏，发菌结束时，菌丝能覆盖整个料面并吃透培养料。7 d后待菌丝长满培养料后进行22℃光照转色。转色第3天，料面形成米黄色斑点，并且面积逐步扩大;转色约6 d时菌丝吐水并在料面形成水珠，同时开始渐渐形成草基;7 d后完成转色，在塑料封口膜上打孔进行出草管理，连续光照并定时喷水保湿，48 d后采草。随机取10瓶蛹虫草进行样品处理，称其鲜草重量算得其生物转化率，60℃烘干后，计算出每瓶的平均干重和鲜干比，试验结果见表2。由表2可知，6号菌株的平均干重和鲜干比都高于其他菌株，说明6号菌株的产量高，适合工业化的大规模生产。

表2 不同菌株人工栽培试验结果Table 2 Test results of different strains on artificial cultivation

2.4 不同菌株子实体活性物质测定结果

提取并测定虫草多糖和虫草素的含量，作为筛选优良菌株的所含活性物质的指标之一。不同菌株子实体多糖和虫草素的提取测定结果见表3。由表3可知，6号的粗多糖和虫草素含量均高于其他菌株，粗多糖含量比相同条件下提取的1号菌株高17.0%，虫草素含量比相同条件下的K36菌株高41.3%。

表3 不同菌株子实体多糖和虫草素的试验结果Table 3 Test results of different strains on fruitbody polysaccharide and cordycepin

3 结论

通过对不同蛹虫草菌株的菌丝生长状态的观察和速度的测定、液体培养生物量积累的测定、人工栽培的子实体形态的观察和生物转换量的测定以及对子实体中活性物质虫草多糖和虫草素的提取和检测，从5株蛹虫草中筛选出6号菌株，其菌丝萌发快、长势好，液体培养生物量积累量高，子实体形态优良、产量高，子实体中所含活性物质虫草多糖和虫草素的量均高于其他菌株。所以，基于6号的这些特点，说明6号可以作为生产用的液体菌种，是值得人工栽培、研究开发和推广的好品种。

［1］ 杨志超，杨姗姗.食药用菌生产与消费指南［M］.北京:中国农业出版社，1997:289-295.

［2］ 张甲生，马如冰，何玲，等.蚕蛹虫草和冬虫夏草中无机元素的比较［J］.中国食用菌，1991，10(2):43-44.

［3］ 陈艳秋.蛹虫草人工优质高产栽培技术研究［J］.中国食用菌，2002，21(5):20-22.

［4］ 李森柱，夏凤娜，杨小兵.蛹虫草5个选育菌株的品比试验［J］.中国食用菌，2006，25(6):15-16.

［5］ 王英娟，李多伟，王义潮，等.蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究［J］.西北植物学报，2005，25(9):1863-1867.

［6］ Ing-Lung Shih，Kun-Lin Tsai，Chienyan Hsieh.Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris［J］.Biochemical Engineering Journal，2007，33(3):193-201.