生物活性肽-蛋氨酸脑啡肽对成骨细胞增殖的影响

薛明，高阳，杨谛，仇丽鸿

(1.中国医科大学口腔医学院牙体牙髓科辽宁省口腔医学研究所牙体牙髓病研究室，辽宁沈阳110002;2.沈阳市铁西区中心医院口腔科，辽宁沈阳110021)

骨组织吸收是根尖周病变和牙周病变中一个重要的病理改变，其治疗的最终目的是诱导成骨细胞增殖，分泌基质从而矿化为骨组织，使缺失的牙槽骨重建［1］。成骨细胞的增殖受多种因素相互作用的影响，包括激素、细胞因子和局部生长因子等，这些因素的存在能够影响骨组织形成和矿化［2］。本实验研究蛋氨酸脑啡肽(Methionine Enkephalin，MENK)对成骨细胞增殖的影响，探讨影响成骨细胞增殖的病理机制。

1 材料与方法

1.1 材料

MC3T3-E1，中国科学院细胞库;DMEM培养基，Gibco(美国);10%胎牛血清，天津灏洋生物制品;胰蛋白酶，Amresco(美国);MENK，纯度:＞97%，美国Penta生物技术公司出品，批号:TH10002。

1.2 方法

1.2.1 MC3T3-E1细胞的培养从液氮中取出冻存的MC3T3-E1细胞，迅速放入37℃温水中，轻轻摇动冻存管令其内容物尽快融化。用吸管吸出细胞悬液至离心管，加入新鲜培养基10 mL，轻吹悬浮细胞，1 000 r/min离心5 min，去上清，再用培养液重复洗1次。将MC3T3-E1细胞以5×105个/mL密度接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于含5%CO2、37℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养，24 h后换液1次。当细胞生长状态良好，至覆盖培养瓶底80%时，以0.25%胰蛋白酶消化，进行传代。

1.2.2 细胞增殖的测定取生长状态良好、几乎长满瓶底的MC3T3-E1细胞进行传代，制备成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板，分为1个对照组和10个实验组，每组设3个复孔，每孔100 μL。37℃、5 ml/L CO2培养箱培养24 h。实验组分别加入100 μL终浓度分别为10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10mol/L的MENK，对照组加入等体积的DMEM培养基，继续培养48 h。各孔加入MTT 10 μL，继续培养4 h。吸出培养液，每孔各加入二甲基亚砜100 μL，作用10 min后，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度值(A570nm)。

1.2.3 统计学处理应用SPSS11.0软件包对实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，实验组与对照组比较采用Dunnett-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

MENK对成骨细胞的增殖有促进作用，与对照组比较，10－7、10－8、10－9mol/L的MENK的促增殖作用有统计学意义(P＜0.05)(表1、图1)。

表1 各组成骨细胞的平均吸光度值(A570nm)Table 1 The mean absorbency values of osteoblasts(A570nm)

续表

图1 不同浓度组的MENK对成骨细胞增殖的影响Fig.1 The effect of MENK on the proliferation of osteoblasts

3 讨论

阿片类药物早已被人们所熟知，其既有强大的镇痛作用，又有明显的欣快感觉及成瘾作用，随着研究的深入，发现体内存在着与阿片受体相结合的内源性阿片样物质，MENK是其中之一，由肾上腺产生的前激素和前脑啡肽衍生而来。MENK是由5个氨基酸组成的五肽，在神经系统、免疫系统、肿瘤组织和正常组织中均有分布，被称为新型的细胞因子［3］。关于MENK的研究，目前主要集中在以下方面［4］:抗肿瘤作用、镇痛作用、抗微生物感染作用、免疫功能增强作用、治疗艾滋病的作用等。另外，MENK还具有非阿片样作用，如调节细胞生长等［5］。

研究表明MENK在不同情况下，对不同细胞可以产生不同的生物效应，但MENK的作用机理并不十分清楚，MENK可以通过多种途径将信号传递到细胞内而发挥作用。在不同情况下，如不同的使用剂量有可能导致MENK结合不同的受体，信号传递主要途径就可能发生变化，也就产生了不同的生物效应［4］。Elhassan等［6］研究表明，MENK在不同的骨组织中分布不同。在表达Ⅰ型胶原蛋白的成熟骨基质中，MENK分布较多，而在成骨细胞中，分布相对较低。在骨和软骨发育过程中，脑啡肽原的活性较高［7］。在成骨细胞表面，发现了3种内源性脑啡肽的受体［8］。这些研究提示，MENK在骨形成过程中起到一定作用。在本实验中，将不同浓度的MENK作用于成骨细胞，来观察其对成骨细胞的作用，结果表明，10－7、10－8、10－9mol/L的MENK对成骨细胞的增殖具有促进作用。正常人血浆中MENK的浓度为10－11mol/L［4］，而本实验中的有效作用浓度均高于生理浓度，提示MENK可作为药物，在骨缺损疾病中发挥促进骨组织重建的作用。

MENK生产简单，分子量小，毒副作用少，并且伴随着神经化学和分子生物学技术的发展，特别是阿片受体的基因剔除、计算机的模拟结构分析等技术的应用，MENK将会更多的被应用于临床治疗领域。本实验中10－7、10－8、10－9mol/L的MENK能够促进成骨细胞增殖，为以骨缺损为主要病理表现之一的慢性根尖周病的药物治疗提供了一个新的思考方向。

［1］ 赵秀敏，艾红军，常新.成骨细胞和破骨细胞的传导通路和相关因子［J］.中国实用口腔科杂志，2009，2(3):176-179.

［2］ Kessler S，Katler S，Mayr-Wohfart U，et al.Stimulation of primary cultures with rh-TGF-beta，rh-bFGF，rh-BMP2 and rx-BMP4 in an in vitro model［J］.Orthopade，2000，29(2):107-111.

［3］ KOWALSKI J，MAKOWIECKA K，BELOWSKI D，et al.Augmenting effect of methionine-enkephalin on interleukin-6 production by cytokine-stimulated ro utine macrophages［J］.Neuropeptides，2000，34(3/4):187-192.

［4］ 张领兵.蛋氨酸脑啡肽研究进展及其应用前景［J］.国外医学免疫学分册，2005，28(6):345-348.

［5］ Wollemann M，Benyhe S.Non-opioid actions of opioid peptides［J］.Life-Sci，2004，75(3):257-270.

［6］ Methionine-enkephalin in bone and joint tissues［J］.J Bone Miner Res，1998，13(1):88-95.

［7］ Rosen H，Krichevsky A，Polakiewicz RD，et al.Developmental regulation of proenkephalin gene expression in osteoblasts［J］.Mol Endocrinol，1995，9(11):1621-1631.

［8］ Perez-Castrillon JL，Olmos JM，Gomez JJ，et al.Expression of opioid receptors in osteoblast-like MG-63 cells，and effects of different opioid agonists on alkaline phosphatase and osteocalcin secretion by these cells［J］.Neuroendocrinology，2000，72(3):187-194.