一多重耐药单增李斯特菌株的生长特性及毒力分析

邵美丽，许岩，赵燕丽，李建斌，刘春阳

(东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030)

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，L.M.)作为国际公认的四大食源性致病菌之一，在食品中具有较高的污染率，自2000年以来，我国上海、浙江、广东、广西、深圳等部分省市统计表明，肉类食品中该菌的污染率已达16%左右［1-3］。且由于抗生素在食源性动物中的广泛使用，导致该致病菌表现出多重耐药的发展趋势，这给食品安全管理及该病的防治工作带来巨大隐患。因此，单增李斯特菌已成为各级食品安全部门重点监管监测的对象之一。2008年，本课题组开展了哈市生肉中单增李斯特菌的污染状况调查及其耐药性分析这一研究课题。期间，课题组分离到1株特殊的单增李斯特菌。该菌株不仅具有超强的耐药性(17种抗生素耐受)，同时其单个菌落明显大于其他标准菌株。为详细了解该多重耐药菌株的其他生物学特征，为其耐药性与生物学特征相关性的探讨奠定基础，本课题组进一步对该多重耐药菌株的生长及其毒力特性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株标准菌:L.M.54006;试验菌:L.M.B8(从生肉中分离得到)。

1.1.2 动物及饲养清洁级昆明小白鼠购自哈尔滨医科大学，于温度22～25℃，湿度45%～55%的环境中饲养，自由摄食、饮水，饲养观察1周后用于试验。

1.1.3 培养基TSA-YE固体培养基、TSB-YE液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单增李斯特菌的生长特性测定①液体菌种的制备:将L.M.B8和L.M.54006(标准菌株)按照1%的比例接种到TSB-YE液体培养基中，35℃，180 r/min条件下振荡培养至菌液OD600达到0.4～0.5后作为菌种备用;②NaCl对单增李斯特菌生长的影响:取L.M.B8和L.M.54006液体菌种各1 mL，分别接种到含NaCl(%)0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的100 mL TSBYE液体培养基(pH 7.2～7.4)，35℃，180 r/min条件下振荡培养12 h，然后测定各NaCl含量下2菌株的OD600值。以NaCl含量(%)为横坐标、OD600值为纵坐标，绘制曲线;③pH对单增李斯特菌生长的影响:取L.M.B8和L.M.54006液体菌种各1 mL，分别接种到pH为3、4、5、6、7、8、9、10的100 mL TSB-YE液体培养基(0.5%NaCl)，35℃，180 r/min条件下振荡培养12 h，然后测定各pH条件下两菌株的OD600值。以pH为横坐标、OD600值为纵坐标，绘制曲线;④温度对单增李斯特菌生长的影响:取L.M.B8和L.M.54006液体菌种各1 mL，分别接种到100 mL TSB-YE液体培养基中(pH 7.2～7.4、0.5%NaCl)，分别于5、10、15、20、25、30、35、40、45和50℃，180 r/min条件下振荡培养12 h，然后测定各温度条件下两菌株的OD600值。以温度为横坐标、OD600值为纵坐标，绘制曲线;⑤单增李斯特菌生长曲线的测定:将L.M.B8和L.M.54006液体菌种各1 mL分别接种到100 mL TSB-YE液体培养基中(pH 7.2～7.4、0.5%NaCl)，在35℃，180 r/min条件下振荡培养，分别在0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 h取样，然后测定2菌株的OD600值。以培养时间为横坐标、OD600值为纵坐标，绘制2菌株的生长曲线。

1.2.2 单增李斯特菌的半数致死量的测定清洁级昆明小白鼠110只，体重18～22 g，随机分成11组，即L.M.B8设5个剂量组(按由低到高剂量，分别设为第1组、第2组、第3组、第4组、第5组)、L.M.54006设5个剂量组(按由低到高剂量，分别设为第6组、第7组、第8组、第9组、第10组)和1个对照组(设为第11组)，每组10只，雌雄各半。参照简化寇氏法［4］，首先进行预实验，确定死亡率在0～100%的剂量范围为1.6×105～108cfu/mL，相邻2组的剂量比为5。然后进行正式试验，染毒途径为腹腔注射，染毒剂量为0.1 mL/20 g，L.M.B8和L.M.54006的5个剂量组的染毒剂量分别为1.6×105、8×105、4×106、2×107和108cfu/mL。对照组注射等体积的生理盐水。染毒后，连续观察7 d，记录各组动物死亡情况。将试验结果代入计算公式，求出LD50及其95%可信限。

2 结果

2.1 NaCl对单增李斯特菌生长的影响

试验结果(图1)表明，在NaCl浓度为0.5%～11%范围内，随着浓度的增加L.M.B8和L.M.54006培养液的OD600逐渐降低。在0.5%～8%浓度范围内，二者培养液的OD600均高于0.5，说明在此NaCl浓度范围内，两菌株均能良好生长。但在0.5%～5%NaCl浓度范围内，L.M.B8培养液OD600均明显高于L.M.54006培养液OD600，而当NaCl浓度高于5%后，L.M.B8培养液的OD600降至与L.M.54006培养液OD600相似水平。且当NaCl浓度由3%增至5%时，L.M.B8培养液OD600下降了35.84%，明显高于L.M.54006培养液OD60017.74%的下降幅度。

图1 NaCl对单增李斯特菌生长的影响Fig.1 Influence of NaCl on growth of Listeria monocytogenes

2.2 pH对单增李斯特菌生长的影响

试验结果(图2)表明，二者最适pH值均为8.0。pH＜4.0时，L.M.B8和L.M.54006几乎不生长。在pH范围为4.0～10.0时，2菌株培养液的OD600随着pH的增加而逐渐增大，当pH为8.0时，OD600增至最大，之后随着pH增加而OD600逐渐降低。且在pH4.0～10.0范围内，L.M.B8培养液OD600一直高于L.M.54006培养液OD600，说明L.M.B8在此pH范围内的生长速度明显高于L.M.54006。

图2 pH对单增李斯特菌生长的影响Fig.2 Influence of pH on growth of Listeria monocytogenes

2.3 温度对单增李斯特菌生长的影响

试验结果(图3)表明，L.M.B8和L.M.54006最适温度值为35℃。L.M.54006在25～45℃范围内有良好生长，在25～35℃范围内，随着温度升高L.M.54006培养液OD600逐渐增大，至35℃时增值最大，而后随着温度增加，其OD600逐渐降低。L.M.B8则在20～45℃之间均有良好生长，其变化规律与L.M.54006相似，但其培养液OD600均明显高于L.M.54006培养液OD600。当温度高于45℃或低于15℃，2菌株的生长明显受到抑制。

图3 温度对单增李斯特菌生长的影响Fig.3 Influence of temperature on growth of Listeria monocytogenes

2.4 单增李斯特菌生长曲线的测定

单增李斯特菌的生长曲线见图4，L.M.B8的迟缓期为0～2 h，对数生长期为2～4 h，稳定期为4～6 h，衰亡期为6 h以后。而L.M.54006的迟缓期为0～3 h，对数生长期为3～6 h，稳定期为6～12 h，衰亡期为12 h以后。

图4 单增李斯特菌的生长曲线Fig.4 Growth curve of Listeria monocytogenes

2.5 单增李斯特菌的半数致死量结果

具体结果见表1。半数致死量(LD50)按以下公式计算:LD50=log－1［Xm－i(∑p－0.5)］，式中:Xm为最大死亡率组剂量对数;i为相邻剂量比值的对数;∑p为各组死亡率总和。将所得数据代入上式算得L.M.B8小鼠腹腔注射的LD50为4.68×105cfu/mL，L.M.54006小鼠腹腔注射LD50为1.09×106cfu/mL。

LD50的95%可信限(FL)按以下公式计算:log－1(log LD50±1.96×SX50)，式中SX50为logLD50的标准误差。将所得数据代入上式算得L.M.B8小鼠腹腔注射LD50 95%可信限为1.66×105～1.32×106cfu/mL。L.M.54006小鼠腹腔注射LD50 95%可信限为4.37×105～2.75×106cfu/mL。

表1 小鼠腹腔注射单增李斯特菌后的死亡情况Table 1 The mortality of mice exposed to Listeria monocytogenes by intraperitoneal injection

3 讨论

近年来，食源性致病菌对食品的广泛污染导致食源性疾病的发病率在全球范围内呈上升趋势，加之食源性致病菌日趋严重的耐药现象，给食源性疾病预防和治疗带来了巨大困难。随着对细菌耐药机制研究的不断深入，人们发现细菌耐药性的产生与细菌的其他生物学特性可能存在一定关联，尤其对细菌的毒力可能产生一定的影响［5］。目前，国内外对此方面的报道不多，有关单增李斯特菌耐药性与其生物学特性相关性的研究尚未见报道。

2008年，本研究室在对哈尔滨市售128份生肉样品进行单增李斯特菌的污染状况调查及耐药性分析时，发现了1株耐药性极强的菌株L.M.B8，该菌株对四环素、红霉素、万古霉素等17种抗生素耐受。不仅如此，试验过程中发现，L.M.B8的菌落特征发生明显变化，其菌落大小为其他标准菌株的2倍左右。为了进一步详细了解L.M.B8的生长及毒力特性，课题组针对NaCl浓度、pH值、温度对L.M.B8生长的影响及其生长曲线进行进一步研究，同时对该菌株的LD50进行了测定分析。结果发现，NaCl浓度、pH值及温度对L.M.B8和L.M.54006的影响规律基本一致，且L.M.B8生长的最适盐浓度、最适pH值及最适温度均与L.M.54006相同，但在最适生长条件下其生长速度均明显高于L.M.54006。不仅如此，在NaCl浓度为0.5%～5%、pH值为4.0～10.0及温度为20～45℃范围内，L.M.B8的生长速度均明显高于L.M.54006。但在3%～5%NaCl浓度范围内，随着盐浓度增大，L.M.B8培养液OD600下降幅度明显大于L.M.54006，说明L.M.B8对高浓度盐的敏感性高于L.M.54006。此外，L.M.B8在20～45℃之间均能良好生长，而L.M.54006只是在25～35℃范围内才能良好生长，说明L.M.B8对温度的适应范围明显宽于L.M.54006。从生长曲线看，二者有明显区别，L.M.B8的对数生长期与稳定期均较L.M.54006提前2～3 h，同时L.M.B8的稳定期约为3 h，明显短于L.M.54006 6 h左右的稳定期。从以上可以看出，L.M.B8的生长特性与标准菌株L.M.54006相比，确实发生了一定的变化，这种变化可能与该菌株的多重耐药性有一定相关性，但此变化与王丽平［6］研究的诱导耐药后的猪链球菌生长速度滞后于诱导耐药前的生长速度这一结果明显不同，原因可能与细菌种类及具体耐药种类不同相关。

此外，L.M.B8和L.M.54006小鼠腹腔注射的LD50结果表明，L.M.B8 LD50为4.68×105cfu/mL，低于L.M.54006的LD50 1.09×106cfu/mL，说明L.M B8的毒力较L.M.54006有所增强。此结果与文献报道的用甲硝唑诱导产生的脆弱拟杆菌耐药菌的毒力有所增强的结果相似［7-9］，与王丽平［6］研究的猪链球菌耐药菌株LD50值较标准菌株LD50值降低这一趋势也相一致，但与2000年Anna等［10］报道的肺炎球菌耐青霉素菌株由于其PBPs发生变异导致细菌毒力下降的结果相反，这说明细菌耐药性的产生可能会引发菌株的毒力变化，但这种变化有细菌种属特异性。

［1］ 陆屹.2003年上海市部分食品中食源性致病菌污染情况分析［J］.上海预防医学杂志，2004，16(9):449-451.

［2］ 梅玲玲，程苏云，朱敏.2000～2004年浙江省食品中产单核李斯特菌污染状况调查［J］.中国卫生检验杂志，2006，16(7):784-785.

［3］ 宋曼丹，倪汉忠，杨冰.广东省食品中单核细胞增生李斯特菌污染状况调查［J］.中国卫生检验杂志，2004，4(1):81-82.

［4］ 刘宁.食品毒理学［M］.北京:中国轻工业出版社，2006:96-100.

［5］ Lorian V，Gemmel C G，et al.Effect of low antibiotic concentrations on bacteria:effects on ultrastrastructure，virulence，and susceptibility to immune defenses［M］.Antibiotics in Laboratory Medicine，1994:459-493.

［6］ 王丽平.动物源链球菌的耐药性与毒力的关系及感染对小鼠肝药酶活性的影响［D］.南京农业大学博士学位论文，2005:100-110.

［7］ Claudio G D，Rosa M A，Denise C C，et al.Enhanced pathogenicity of susceptible strains of the Bacteroides fragilis group subjected to low doses of metronidazole［J］.Microbes and infection，2003，5(1):19-26.

［8］ Diniz C G，Cara D C，Nicoli J R，et al.Effect of metronidazole on the pathogenicity of resistant Bacteroides strains in gnotobiotic mice［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44(9):2419-2423.

［9］ Ferreira M C，Domingues M C，Uzeda M.Infulence of metronidazole，chloramphenicol clindamycin and penicillin G on growth and neuraminidase activity of Bacteroides fragilis［J］.J Antimicrob Chemother，1989，24(2):157-164.

［10］ Anna B M，Ann H，Asa M.Experimental study of the virulence of Streptococcus pneumoniae with reduced susceptibility to penicillin［J］.Internationa Journal of Pediatric Otorhinolaryngology，2000，55(1):1-9.