AEG-1与CXCR4对乳腺癌脑转移的影响

曲明阳 李 森 赵胜男 邢光明

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。随着综合治疗的发展，乳腺癌患者的寿命得以延长，而脑转移的发病率却逐渐升高，经尸检证实脑转移发病率达到30%[1]。发生脑转移将严重影响患者的生活质量及生存时间[1]。因此对脑转移相关基因的研究具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例选择

选择1997～2007年首发的乳腺癌患者78例，随诊至2011年4月。以发生脑转移的33例患者作为病例组，以随机选取的未发生脑转移的45例患者为对照组(上述患者原发乳腺癌均经手术治疗)。

1.2 免疫组化

将切片按常规脱蜡后水化。将抗原放入0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲剂中并加热进行抗原修复，1分36秒后取出，PBS漂洗。在3%过氧化氢溶液中浸泡20 min，PBS洗5 min，在37℃下用正常山羊血清封闭20 min，用PBS冲洗3次，在兔单克隆抗人抗体：抗AEG-1抗体、抗CXCR4抗体(北京博奥森生物技术有限公司生产)中保持4℃孵育过夜。生物素标记的羊抗兔IgG中孵育20 min，PBS漂洗，辣根过氧化酶孵育20 min。PBS漂洗后，DAB显色，镜下观察结果，适时终止。然后以苏木精复染、75%的盐酸酒精分化，蒸馏水冲洗蓝化、封片。

1.3 评定标准

AEG-1及CXCR4主要在胞质中表达，以胞质内出现棕黄色颗粒或团块为阳性细胞。阳性百分率采用半定量判断标准[2,3]，即随机选取5个不同高倍视野(200×)，按肿瘤阳性细胞率和染色强度分别进行计分：阳性细胞率<5%为0分,6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色计分分为4个等级：0(阴性)，1(弱阳性)，2(阳性)，3(强阳性)。两者的乘积为最终的染色结果评定：1～4分为低表达(-)，5～12分为高表达(+)。

1.4 统计学分析

采用SPSS PASW(版本18.0)统计软件包，应用χ2检验分别对病例组及对照组的单因素进行统计分析。应用多因素Logistic回归进行多因素与乳腺癌脑转移的相关性分析。

2 结果

2.1 AEG-1及CXCR4在乳腺癌脑转移组与非转移组中的表达

33例脑转移者中21例为AEG-1阳性，阳性率为63.6%；45例无转移者中共有14例为AEG-1阳性，阳性率31.1%，脑转移组明显高于非转移组(P=0.004)，提示AEG-1阳性者的转移可能性较高。33例脑转移者中20例为CXCR4阳性，阳性率为60.6%；45例无转移者中共有15例为CXCR4阳性，阳性率33.3%，明显低于脑转移组(P=0.017)，提示CXCR4阳性者的转移可能性较高，见表1。

表1 乳腺癌脑转移组与非脑转移组χ2检验比较(78例)

2.2 logistic回归分析

应用logistic回归分析对乳腺癌脑转移与各种危险因素的关联性进行分析，将影响乳腺癌患者脑转移的各危险因素代入多因素logistic回归模型进行分析，建立logistic多因素回归分析模型。结果显示：AEG-1及CXCR4可能是乳腺癌患者发生脑转移的独立危险因子，见表2。

表2 多因素logistic回归分析逐步筛选后结果

3 讨论

AEG-1是近年来发现的与多种肿瘤的形成、侵袭、进展、转移有关的原癌基因。AEG-1基因分子量约为64 KD，其表达产物是1种胞质蛋白[4]。值得注意的是AEG-1在乳腺癌等恶性肿瘤细胞中的表达明显升高，而在正常细胞系及相关良性细胞系中则低表达或不表达[5]。有实验证明AEG-1的过表达能增加肿瘤的转移和侵袭，AEG-1基因沉默能降低人肿瘤的转移和侵袭。Brown等的研究结果显示，当AEG-1基因处于沉默低表达状态时，乳腺癌向肺部的转移能力则大大减弱,说明AEG-1对乳腺癌的定向转移起到重要作用，可能参与调节转移部位的定位[6]。本实验中33例脑转移组中有21例为AEG-1阳性，阳性率为63.6%；对照组45例中14例为阳性，阳性率为31.1%，经χ2检验，两组间存在显著差异。说明AEG-1阳性乳腺癌患者发生脑转移的可能性较阴性者高。多因素logistic回归分析结果显示，AEG-1的优势比为3.464，回归系数为1.242，说明AEG-1是乳腺癌脑转移的危险因素。所以在临床上对于AEG-1阳性患者应严密监测、随诊神经系统的症状及CT、MRI的颅脑表现，做到乳腺癌脑转移的早发现，以便早期治疗，改善生活质量，延长生存年限。同时也可考虑对此类患者进行预防性治疗，针对AEG-1靶向抑制来防止脑转移发生。

趋化因子受体 CXCR4 是 G 蛋白偶联受体超家族成员,最早发现 CXCR4 与免疫细胞的“归巢”和信息传递相关。近年来,研究发现 CXCR4 在多种肿瘤中均有表达,并且在肿瘤增殖、浸润、血管新生及转移等过程中起到非常重要的作用[7]。CXCL12是目前已知唯一能与CXCR4结合并能激活它的天然趋化因子，所以近年来提出了CXCL12/CXCR4生物学轴的概念，并对其进行了众多研究，证实了其在肿瘤中的上述作用。动物实验发现,利用特异性的抗体、选择性合成多肽以及siRNA阻断 CXCR4 可以明显抑制乳腺癌向淋巴结和肺的转移，证实了CXCL12/ CXCR4 通路参与诱导了肿瘤细胞向特异性的部位“归巢”[8],即诱导器官特异性的转移。研究还发现,淋巴结、肺、肝、脑及骨髓这些肿瘤常见的转移部位均发现 CXCL12高表达[9],从而趋化了肿瘤器官特异性转移，而CXCL12表达低的器官如肾脏、乳腺癌则一般不转移至此类部位。尽管肿瘤转移的分子机制还没有被完全阐明,但是上述研究均表明 CXCL12/CXCR4 在肿瘤转移过程中起到非常重要的作用。Salvucci等[10]对2000余例乳腺肿瘤标本的CXCR4 的表达进行检测，结果发现CXCR4在正常组织、原位导管癌及侵袭性癌中的阳性表达率分别为20%,43%,67%,由此证实CXCR4 的高表达与乳腺癌进展及转移相关。本研究33例脑转移患者中CXCR4阳性者20例，占60.6%，明显高于无转移组CXCR4阳性者的33.3%。χ2检验显示两组存在显著统计学差异。多因素logistic回归分析结果显示CXCR4的优势比为4.688，回归系数为1.545，说明CXCR4是乳腺癌脑转移的危险因素，其表达阳性者更容易发生脑转移。

AEG-1及CXCR4作为新近发现的与乳腺癌脑转移有密切联系的基因，很多实验研究证实，这两者在癌组织转移过程中起到重要作用，但其作用机制尚未明确。随着研究的开展，其有望成为针对乳腺癌脑转移的高特异性早期指标和基因治疗靶点，为临床乳腺癌脑转移的诊治提供1个新的途径。

[1]Lin NU，Bellon JR，Winer EP.CNS metastases in breast c-ancer〔J〕.J Clin Oncol， 2004,22(17):3608.

[2]Altundag K,Bondy ML,Mirza NQ,et al.Clinico pathologic characteristics and prognostic factors in 420 metastatic breast cancer Patients with central nervous system metastasis〔J〕.Cancer,2007,110(12):2640.

[3]Hongtao Song，Cong Li，Rui Li，et al.Prognostic significance of AEG-1 expression in colorectal carcinoma〔J〕.Int J Colorectal Dis,2010,25:1201.

[4]Ash SC，Yang DQ，Britt DE.LYRIC/AEG-1 overexpression modulates BCCIPalpha protein levels in prostate tumor cells〔J〕.Biochemical and Biophysical Research Communications,2008，371(2):333.

[5]Emdad L，Sarkar D，Lee SG，et al.Astrocyte elevated gene-1:a novel target for human glioma therapy〔J〕.Mol Cancer Therapeutics,2010，9(1):79.

[6]Brown DM,Ruoslahti E，Metadherin.A cell surface protein in breast tumors that mediates lung metastasis〔J〕.Cancer Cell,2004,5(4):365.

[7]Liang Z，Yoon Y，Votaw J，et al.Silencing of CXCR4 blocks breast cancer metastasis〔J〕.Cancer Res，2009，65(3):967.

[8]Wang X，Li C，Chen Y，et al.Hypoxia enhances CXCR4 expression favoring mieroglia migration via HIF—lalpha activation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008，371(2)：283.

[9]Hassan S，Baccarelli A，Salvueei O，et al.Plasma stromal Cell—derived factor-1：host derived marker predictive of distant metastasis in breast eancer〔J〕.Clin Cancer Res，2008，14(2)：446.

[10]Salvucci O，Bouchard A，Baccarelli A，et al.The role of CXCR4 receptor expression in breast cancer: a large tissue microarray study〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2006,97(3):275.