SiRNA逆转T24/ADM细胞耐药性的研究

陈从波 姚启盛 王晓康 杨 勇 刘正清

有研究表明，在膀胱癌的多药耐药产生机制中，多药耐药基因(multidrug resistance gene，MDR1)编码的糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的过度表达是肿瘤细胞产生耐药的分子基础。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是1种有效抑制基因表达的技术，能够特异而有效地引起转录后基因沉默在mRNA水平关闭相应基因的表达，具有稳定、特异、低毒以及作用持久等特点。本研究设计以人膀胱癌细胞系/阿霉素(T24/ADM)细胞株MDR1基因为靶标的小干扰RNA，观察其对MDR1基因表达及细胞株耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及器材

人膀胱癌细胞株T24购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。阿霉素(adriamycin，ADM)(深圳益飞医药化工有限公司)，RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亚砜(DMSO,SIGMA公司)，酶联免疫检测仪(BIO-RAD550，美国伯乐公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)，PCR仪(美国BD公司)。

1.2 siRNA的设计与合成

根据GeneBank mdr1基因已知序列(基因编号NM000927)按siRNA序列设计的原则，从转录本mRNA的AUG起始密码开始，选取3条含21个碱基的序列，由上海生化工程公司合成其正义和反义单链，最后用SilenceTM siRNA Construction Kit(Ambion 公司)试剂盒体外转录正义和反义单链成双链siRNA，设随机序列作为阴性对照(si-neg)。SiRNA的序列如下：5′ GAGCUUAACACCCGACUUAUU3′,5′GAAAGUAUACCUCCAGUUUUU 3′,5′GAC CAUAAAUGUAAGGUUUUU3′。

1.3 细胞培养及转染

T24细胞在RPMI 1640完全培养基中培养(10%小牛血清)，于37℃、5% CO2的培养箱中培养。采用ADM浓度梯度递增诱导法，直至细胞能在含1.0 mg/L 阿霉素的培养基中维持生长，并能稳定传代30代以上，即成为耐药人膀胱癌细胞模型T24/ADM，耐药细胞在含0.1 mg/L ADM的培养液中培养。实验前无药培养两周。参照文献[1]，用Oligofectamine 转染试剂(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)，按试剂盒操作说明优化转染条件,分别将3对siRNA以200 nmol/L的终浓度加入到T24/ADM细胞培养液中，孵育24～48 h后收获细胞进行检测。实验重复3次。

1.4 RT-PCR

应用TRIZOL试剂(Gibico)提取细胞总RNA。根据NCBI中cDNA序列设计引物，以β-actin作为检测的内参照，PCR反应引物由上海生物工程有限公司合成，其序列分别为，β-actin：F 5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’和R 5’-AGCCATGCCAAATGTCTCAT-3’,其cDNA扩增产物为286 bp。MDR1:F 5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’和R5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’,其扩增产物为167 bp。采用一步法进行单管RT-PCR，反应总体系为25 μl。反应完成后取10 μl样品在2%琼脂糖凝胶中电泳，自动电泳凝胶扫描分析系统(Chiemlmage 5500)扫描凝胶并进行定量分析。

1.5 Western方法检测P-gp表达

将经过siRNA转染48 h后的各组T24/ADM细胞，用PBS洗涤2次，取对数生长期的细胞，加入RIPA (美国Pierce)裂解液。冰上静置10 min后，4℃ 、14 000 r/min，离心10 min后取上清。采用BCA法(美国Pierce)进行蛋白定量后，蛋白样品加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液混匀，置于沸水浴中加热10 min。蛋白样品(每孔上样量均为20 μg总蛋白)用SDS-PAGE凝胶(10% ，Invitrogen公司产品)进行电泳分离，分离的蛋白条带转移至PVD膜，并与抗人P-gP及β-actin的第一抗体于4℃孵育过夜后，再与辣根过氧化物酶标记的第二抗体反应，DAB显色。实验设置4组：①对照组，T24/ADM细胞；②阴性对照组，空转染组；③T24细胞组；④转染组。

1.6 MTT 法检测ADM的半数抑制浓度(IC50)

将经SiRNA转染48 h后的各组T24/ADM细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，在96孔板的各孔中加入180 μl 细胞和不同浓度ADM，培养72 h后,加入MTT液20 μl/孔，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，充分震荡10 min，应用酶联免疫分析仪测波长570 nm处每孔的光密度值(A570值),按以下公式分别计算相对逆转效率。相对逆转效率=(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)，其中IC50A是T24/ADM细胞的IC50，IC50B是转染siRNA的T24/ADM细胞的IC50，IC50C是T24细胞的IC50。

1.7 细胞内阿霉素(ADM)积累量的测定

将经过siRNA转染48 h后的细胞，按1×106/ml细胞浓度与1 μg/ml的ADM 37℃共同孵育1 h后，冰浴终止ADM的作用，应用流式细胞仪检测细胞内ADM稳态积累量。以未经过处理的T24/ADM细胞作为空白对照。

1.8 统计学处理

应用SPSS13.0进行统计学分析，统计学处理采用t检验，P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 T24/ADM 细胞MDR1 mRNA水平的变化

T24/ADM 细胞经siRNA处理48 h后，3组MDR1mRNA表达水平均下调，见图1。阴性对照组MDR1/β-actin为0.56，另3组MDR1/β-actin分别为0.23、0.18和0.12。

图1 T24/ADM细胞经siRNA作用48 h后MDR1 mRNA表达水平

1为si-negative；2为si-mdr1-1；3为si-mdr1-2；4为si-mdr1-3；5为阴性对照

2.2 T24/ADM 细胞P-gp蛋白表达的变化

经siRNA处理48 h后，P-gp蛋白表达均受到抑制，Western-blot检测结果显示，T24/ADM 细胞中P-gp蛋白表达水平较亲本细胞明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组细胞与阴性对照组细胞P-gp蛋白表达比较，差异无统计学意义。转染siRNA后的细胞P-gp蛋白表达水平明显下降,见图2。

2.3 T24/ADM 细胞药物敏感性的变化

3组siRNA 作用48 h后T24/ADM 细胞对化疗药物的敏感性均增强(表1)，表明所设计的siRNA均可恢复T24/ADM 细胞对化疗药物的敏感性。

图2 各组细胞中P-gp表达的检测

1为对照组细胞；2为阴性对照组细胞；3为T24/ADM细胞；4为si-mdr1-1细胞；5为 si-mdr1-2细胞；6为si-mdr1-3细胞

表1 siRNA作用后T24/ADM细胞的IC50

注：与T24/ADM细胞组比较，*为P<0.05

2.4 T24/ADM细胞内ADM积累量的变化

经siRNA处理48 h的T24/ADM细胞内ADM稳态累积量明显增高(表2)，但与敏感株T24比较，荧光强度和阳性率仍较低。

表2 siRNA处理后细胞内ADM积累量情况

注：与未经处理的T24/ADM细胞组比较，*为P<0.05

3 讨论

目前，膀胱癌的化疗效果不明显，究其主要原因是肿瘤细胞中的多药耐药基因(MDR)的存在，导致很多化疗药物作用失败。RNAi 作为1种新的研究工具，已经在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景。研究表明[2,3]体外合成的小分子dsRNA能直接触发RNAi，这些小分子dsRNA被称为小干涉RNA(small interfering RNA)，即siRNA。Elbashir等[4]首次报道siRNA在哺乳动物体外培养细胞内成功诱导基因特异阻抑以后，siRNA是否可应用于人类疾病的治疗受到了广泛的关注。在肿瘤基因治疗中，通过人合成特定癌基因靶向的siRNA或构建siRNA的表达载体，并导入肿瘤细胞中，可以特异性地抑制目的基因的表达[5]RNAi技术的发展为逆转多药耐药的基因治疗提供了可能[6]。本研究以MDR1基因为目标，针对MDR1基因设计了3条siRNA序列，以探讨干扰RNA技术进行多药耐药逆转的可行性。结果显示，转染后MDR1 mRNA明显下调，48 h后抑制率很高。并且P-gp蛋白的抑制率在48 h的时候也达到很高的水平。目前的研究发现，外源性的siRNA引发的RNAi仅为短时效应，在绝大多数哺乳动物细胞中转染人工合成的短片段RNA后，进行基因和蛋白抑制检测的高峰时间在转染后的48～72 h，一般在转染后3～5 d蛋白的抑制达到最高，5～7 d则恢复到稳定状态。从我们的结果也可以看到，基因和蛋白的抑制基本遵循上述的规律。本研究中，ADM的IC50和ADM的稳态细胞内积累量分析证实，转染siRNA后T24/ADM细胞对ADM的敏感性及细胞内ADM的积累量与对照组相比均有明显差异，本实验结果肯定了siRNA干扰能够有效抑制MDR1基因编码蛋白P-gp的表达，说明siRNA可能成为逆转多药耐药的新方法。

总之，我们应用了针对MDR1 RNA干扰技术，可以有效地抑制MDR1 mRNA表达，能够有效抑制该基因编码的P-gp蛋白表达，从而有效地逆转了肿瘤细胞的耐药性，如果能联合应用多种耐药机制的siRNA，将能更有效地逆转肿瘤细胞的耐药性，为治疗肿瘤提供新的方法。

[1]何一心，杨少光，张淑靖，等.多药耐药性细胞的鉴别和分离〔J〕.中华血液学杂志，1992，13：173.

[2]Scherr M，BattIIler K，Winlkler T，et al.Specific inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA〔J〕.Blood，2003，101：1566.

[3]彭 智，肖志坚，王 一，等.siRNA逆转K562/A02细胞多药耐药研究〔J〕.中华血液学杂志，2004，25：5.

[4]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et,al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001,411(6836):494.

[5]Bulk E,Hascher A,Liersch R.Adjuvant therapy with small hairpin RNA interference prevents non-small cell lung cancer metastasis development in mice〔J〕.Cancer Res,2008,68(6):1896.

[6]Duan Z,Weinstein EJ,Ji D.Lentiviral short hairpin RNA screen of genes associated with multidrug resistance identifies PRP-4 as a new regulator of chemoresistance in human ovarian cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2008,7(8):2377.