Smad2小干扰RNA载体的构建及其沉默效应的鉴定

熊志红 李仁德 朱 琰

Smads蛋白是生长转化因子(transforming growth factorβ，TGF-β)的胞质递质，在TGF-β信号传导通路中起重要的调解作用。其中Smad2参与TGF-β/ activins 信号途径，能调控其下游多种基因的表达。众多研究表明，Smad2蛋白与肿瘤发生、发展、肿瘤血管形成及播散转移密切相关。小RNA干扰(small interfering RNA,siRNA)是目前最有效的基因沉默技术，能特异性抑制靶基因的转录，进而下调相应蛋白水平及功能。我们通过构建smad2基因特异性siRNA真核表达载体，检测其对宫颈癌细胞HeLa中smad2基因的沉默作用，为研究Smad2 与肿瘤发生、发展的相关性奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基为Gibco公司产品，胎牛血清购于杭州四季青公司，Psilencer 2.1-U6-neo表达载体购于Ambion公司，脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 为Invitrogen公司产品，鼠抗人Smad2多克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG及抗Flag抗体为Santa cruz公司产品，限制性DNA内切酶BamHI、HindⅢ和T4 DNA连接酶为NEB公司产品，小量质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购于Axygen公司。化学发光试剂盒购自Santa Cruz公司。Smad2特异性siRNA寡核苷酸链合成和DNA序列测定，由上海生物公司完成。Flag-smad 2、3、4真核表达载体由本实验室构建，大肠杆菌E.coli DH5α、293T细胞和HeLa宫颈癌细胞由本实验室保存。

1.2 smad2特异性siRNA的设计

以smad2基因编码区序列为分析序列，使用Ambion公司网上提供的siRNA设计软件，寻找其上2个相邻的腺嘌呤核苷酸序列(AA)，这2个AA和紧随其后的19个核苷酸成为潜在的siRNA靶位点。通过对基因序列和二级结构的综合分析，确定了2 条特异性寡核苷酸，并由此设计了两条smad2发卡siRNA。siRNA1 正义链为：5′-CAGAACTTCCGCCTCTGGA-3′,反义链为：5′-TCCAGAGGCGGAAGTT CTG-3′；siRNA2 正义链为：5′-CCTGCATTTTGGTGTTCGA-3′,反义链为：5′-TCGAACACC AAAATGCAGG-3′。发卡siRNA包含了上述靶位点的19个碱基及其互补序列，靶序列与互补序列之间由9个碱基(TTCAAGAGA)组成的环隔开，5′和3′端分别含BamHI、HindⅢ酶切位点的黏性末端。

1.3 smad2 siRNA表达载体的构建

参照Ambion公司的使用说明书，各取对应的siRNA的正义链和反义链，在退火缓冲液中，于95℃水浴处理5 min，然后自然冷却至室温；将退火后的双链siRNA模板与经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6，16℃连接过夜；连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞；在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体；BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒。将酶切鉴定正确的重组质粒样品送上海生工公司进行DNA序列分析。

1.4 质粒DNA的制备、纯化及定量

应用Axygen的质粒提取试剂盒，分别提取smad2 siRNA1、2重组质粒及Flag-smad2、Flag-smad3、Flag-smad4重组质粒。应用分光光度计检测，要求质粒的A260 nm与A280 nm比值大于1.8，经琼脂糖电泳观察无任何降解的DNA，可用于细胞的转染。根据A260 nm值计算质粒的浓度。

1.5 smad2 siRNA质粒的细胞转染

将生长状态良好的Hela细胞，用DMEM 培养基(含10%胎牛血清)转种到24 孔板中，每孔0.5 mL，置于5%CO2孵箱内，37℃常规培养，36 h 后即用Lipofectamine 2000 将质粒瞬时转染A549细胞。分别将0.5 μg 质粒或混合质粒与1.6 μL Lipofectamine 2 000，分别溶于50 μL 不含血清及抗生素的DMEM 培养基中，之后将两者混合，室温放置20 min 后加入到含0.5 mL 10%胎牛血清的细胞培养基的24 孔细胞中。

1.6 Western blotting检测细胞中内源及外源Smad2的蛋白表达

重组质粒转染细胞，37℃常规培养24 h后，按常规方法收集细胞，加入适量RIPA 裂解液，超声破碎，于4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清。样品经SDS-PAGE 后，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入抗Smad2的多克隆抗体，室温结合1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，再加入兔抗鼠IGg抗体，室温结合1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，应用化学发光试剂盒显色5 min，X胶片压片显影，或用辣根过氧化酶偶联的FLAG抗体，同上检测蛋白中FLAG标签蛋白的表达。

2 结果

2.1 smad2发卡siRNAs表达载体的设计及构建

应用siRNA设计软件，在smad2基因的编码区中寻找2个相邻的腺嘌呤核苷酸序列(AA),其后紧随的19个核苷酸为潜在的siRNA靶位点；经Blast分析，选择与其他分子无同源性的序列，且G+C含量接近50%。据此本实验设计了2个smad2发卡siRNA的序列，该序列包含siRNA靶点的19个碱基及其互补序列,靶序列与互补序列之间由9个碱基组成的环隔开，两端分别为BamHI、Hind Ⅲ的黏性末端。

化学合成的单链siRNA为线状,一对互补的siRNA单链经退火后形成发卡状结构，且两端含BamHI、Hind Ⅲ的黏性末端，在连接酶的作用下，便可插入到同样BamHI和HindⅢ双酶切处理的siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo中。将酶切鉴定正确的2个siRNA重组质粒，使用siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo的上游通用测序引物M13F，进行插入片段的序列分析，结果表明均获得了插入的siRNA片段，且序列与预先的设计完全相符(测序图略)。表明smad2 siRNA1，smad2 siRNA2表达载体均构建成功。

2.2 smad2 siRNAs对外源smad2基因表达的影响

将带有FLAG标签的smad2重组质粒,分别与构建好的2个siRNA重组质粒、试剂盒提供的与已知的人基因组序列同源性极低的阴性对照siRNA载体，共转染293T细胞。72 h后收集细胞裂解物，应用FLAG抗体进行Western-blot分析结果显示，与转染siRNA对照组相比,转染smad2 siRNA1、2组均能明显抑制细胞中FLAG-smad2融合基因的表达,Smad2蛋白表达水平仅为阴性对照组的20%，而同时检测的内参GAPDH蛋白表达无明显改变(图1)。

图1 Smad2 siRNA对外源性Smad2蛋白表达的抑制

1为293T(FLAG-smad2)，2为293T(FLAG-smad2+siRNA1)，3为293T(FLAG-smad2+siRNA2)

2.3 smad2 siRNAs抑制smad2基因表达的特异性分析

由于smad2与smad3之间有一定的同源性，因此，我们进行了smad2 siRNA1对smad2、smad3、4沉默效应的特异性分析。将带有FLAG标签的smad2、smad3、smad4重组质粒,分别与构建好的smad2 siRNA重组质粒共转染293T细胞。72 h后同样用FLAG抗体对细胞裂解物进行Western-blot分析,结果显示smad2 siRNA仅抑制smad2表达，而对其他smad家族蛋白的表达无影响(图2) 。

图2 Smad2 siRNA特异性抑制Smad2蛋白表达

1为293T(Flag-smad2)，2为293T(Flag-smad2+siRNA1)，3为293T(Flag-smad3)，4为293T(Flag-smad3+siRNA1)，5为293T(Flag-smad4)，6为293T(Flag-smad4+siRNA1)

2.4 smad2 siRNAs对内源smad2基因表达的影响

在HeLa细胞中只转染smad2 siRNAs及siRNA阴性对照载体,应用smad2抗体进行Western-blot分析，结果表明smad2 siRNAs可以抑制内源smad2表达，Smad2蛋白表达水平仅为阴性对照组的30%(图3)。由此可见,所设计的smad2基因siRNA能有效降低肿瘤细胞中内源性smad2基因的表达。

图3 Smad2 siRNA抑制HeLa细胞中内源性Smad2蛋白表达

1为HeLa cells裂解物，2为HeLa cells转染smad2 siRNA后的裂解物

3 讨论

siRNA技术能利用外源导入的双链RNA(dsRNA)抑制细胞内同源mRNA降解，有效、特异地抑制细胞内特定基因的表达。与传统的基因敲除技术相比，siRNA技术投入少、周期短和操作简便，并具有高特异性和抑制率两大明显优势[1]。siRNA抑制基因表达率极高，有的甚至可以完全阻断基因表达，效果接近基因敲除技术，从而成为人们广泛运用于研究基因的功能或基因治疗的重要手段[2]。

Smads家族有9种亚型(Smad1-9)，是转化生长因子TGF-β信号转导途径中1个重要的基因家族[3]。其中smad2与smad3均为受体型分子，是TGF-β信号转导途径中的第一信号分子[4]，能磷酸化后与其他受体型或调节型smad分子组成异聚体，进入细胞核，从而启动一系列下游基因的转录，参与调节细胞增殖、凋亡及分化等多种细胞程序[5]。smads基因突变或功能失活在人类肿瘤的发生中起着重要的作用，但由于肿瘤发生的多因素性及TGF-β信号通路的复杂性，在不同的恶性肿瘤中其机制有所不同,一般认为在肿瘤发生早期，TGF-β信号转导通路对肿瘤生长呈抑制作用；但对进展型和晚期肿瘤呈促进作用，并能增强其侵袭力和恶性程度。已有研究结果显示，Smad2蛋白不同的肿瘤组织中的表达是不一致的：在结肠直肠癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤等肿瘤组织中的smad2表达是上调的[6]，而在乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肺癌和神经胶质瘤等肿瘤组织中，Smad2表达则是明显下调的[7]。研究表明，宫颈癌的发生90%以上与人乳头瘤病毒感染有关，人乳头瘤病毒中的癌基因E7 通过与Smad2、Smad3 、Smad4 相互作用阻断了Smad 的转录活性，并抑制TGF-β活性，从而导致TGF-β通路紊乱而引起肿瘤发生[8]。Smads各组成分在肿瘤发生、发展中的作用，还需要经过深入研究，为肿瘤的防治另辟新径。

我们成功构建了Smad2 siRNA真核表达载体，该载体能特异地、有效地抑制宫颈癌HeLa细胞中Smad2蛋白表达水平,同时对Smad3表达无影响。该siRNA的表达载体，可用于探讨Smad2在肿瘤细胞中的过低表达，是否影响其他重要蛋白的表达水平及其对细胞周期、细胞凋亡等功能的影响，为进一步研究Smad2在肿瘤的发生发展中的功能打下了良好的基础。

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