蜂毒素对人肝癌裸鼠移植瘤的抗血管生成作用

宋长城 吕 祥 程彬彬 李 柏 凌昌全

肝细胞癌 (hepatocelluar carcinoma,HCC) 是临床上最常见的恶性肿瘤之一，在我国肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二[1]。目前，根治性手术仍是 HCC 治疗的首选方法，但术后复发和转移是影响手术疗效的关键因素，且 HCC 的放射及化学治疗效果均不理想。因此，探索新的治疗手段很有必要。从临床上行肝动脉化疗栓塞术治疗 HCC 取得肯定疗效来看，阻断肿瘤血液供应的治疗方法有望成为 HCC 治疗的突破口[2]。蜂毒素是从蜜蜂尾部螫针排出的毒汁中分离提纯的1种动物毒素。它具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛等多种生物学活性。近年来，蜂毒素的抗肿瘤作用日益受到人们关注。体外研究发现，蜂毒素可以通过不同机制对多种肿瘤细胞产生强烈的杀伤作用，是1种十分具有应用前景的抗肿瘤天然药物。本实验通过建立人肝癌 BEL-7402 裸鼠移植瘤模型，观察蜂毒素对裸鼠皮下移植瘤生长的影响，探讨其抗肿瘤血管生成的可能机制，以评价蜂毒素是否具有潜在的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞株

4 ～ 6 周龄 BALB/C - nu/nu 雄性裸鼠，体重 18 ～ 20 g，购自中国科学院上海动物中心，动物合格证号：SCXK(沪) 2002-0002，SPF环境下饲养。人肝癌细胞株 BEL-7402 从中国科学院上海细胞研究所引进，常规传代培养。

1.2 主要试剂

蜂毒素为 Sigma 公司产品，批号：104K4016。鼠抗人 CD34单克隆抗体、鼠抗人 HIF-1α 单克隆抗体、鼠抗人 NF-κB 单克隆抗体和兔抗人 bFGF 多抗隆抗体均购自美国 Santa Cruz 公司。SABC 免疫组化试剂盒购自武汉 Boster 公司。

1.3 方法

1.3.1 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及肿瘤生长观测 取对数生长期 BEL-7402 细胞，调整细胞浓度至 2.5×107/ml，按 0.2 ml/只接种于裸鼠右侧腋窝皮下。待皮下肿瘤直径达 0.5 ～ 0.7 cm 时，将裸鼠随机分为生理盐水 (normal sodium,NS) 组、沙利度胺 (thalidomide,TLD)(200 mg/kg/d) 组、蜂毒素低、中、高剂量组 (40 μg/kg/d、60 μg/kg/d、80 μg/kg/d)。分组后第 2 d 开始给药，每天 1 次，连续 10 d。每 2 d 测量肿瘤长( a )、短径( b )，并称裸鼠体重，实验结束时复测瘤体大小并称重。按下列公式分别计算肿瘤体积 (V)、相对肿瘤体积 (RTV) 和相对肿瘤增殖率 (T/C)：TV = a×b2/2；RTV = V/V0(V0为给药前测量所得体积，V 为处死前测量所得体积)；T/C = 治疗组 RTV/阴性对照组 RTV×100%；肿瘤生长抑制率=(1-治疗组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重) × 100%。

1.3.2 免疫组化染色 严格按照免疫组化 SABC 试剂盒说明书进行操作。参照 Weidner[3]方法进行 MVD 评估。光镜下可见 HIF-1α 和 bFGF 为胞质着色，NF-κB 为胞质或胞核着色，阳性表现为棕色或棕褐色。应用 IMS 细胞图像分析系统对染色切片进行分析，免疫组化阳性表达指数=阳性面积/视野面积×光密度值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 裸鼠移植瘤生长情况

以皮下瘤体直径达 0.5 ～ 0.7 cm 为接种成功标准，裸鼠成瘤率为 100%。治疗前各组裸鼠肿瘤大小无明显差异 (P>0.05)，提示各组瘤体具有可比性。在治疗过程中，NS 组肿瘤生长较快，个别瘤体表面破溃，而蜂毒素各组及 TLD 组肿瘤生长相对缓慢。治疗结束后，蜂毒素低中高剂量组及 TLD 组相对肿瘤体积与 NS 组比较，差异具有统计学意义 (P<0.01)。蜂毒素各组的相对肿瘤增殖率与 TLD 组比较差异无统计学意义 (P>0.05)，见表1。

2.2 蜂毒素对裸鼠及裸鼠移植瘤的影响

在实验过程中各组裸鼠行动自如，反应灵敏，进食饮水正常，皮下未见出血点，无裸鼠自然死亡。实验结束后自眶静脉采血行外周血细胞计数。结果显示，蜂毒素各组及 TLD 组外周血红细胞、血红蛋白、白细胞、血小板水平与 NS 组比较，差异无统计学意义 (P>0.05)。实验结束后颈椎脱臼处死裸鼠，各组动物均未发现胸腔及腹腔积液。取裸鼠心、肺、肝、肾及骨组织做石蜡切片，经 HE 染色未见转移灶。各组裸鼠用药前、后体重见表2，实验期间各组裸鼠体重均有增加，与 NS 组比较差异无统计学意义 (P>0.05)，提示蜂毒素在本实验剂量范围内无明显毒副作用。如表 2 所示，蜂毒素各组瘤重与 NS 组比较差异均有统计学意义 (P<0.01)。与 TLD 组比较，蜂毒素中高剂量组瘤重明显减轻 (P<0.05或P<0.01)，而低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。蜂毒素低中高剂量组抑瘤率分别为 44.64%、62.86% 和 73.73%。

2.3 蜂毒素对裸鼠皮下移植瘤 MVD 的影响

免疫组化染色显示，蜂毒素各组及TLD组瘤体内肿瘤微血管呈棕褐色条索状，血管密度稀疏。与 NS 对照组比较，各药物处理组 MVD 明显下降 (P<0.01)。蜂毒素中、低剂量组 MVD 明显高于 TLD 组 (P<0.01)，而高剂量组与 TLD组比较差异无统计学意义 (P>0.05)，见表3。

2.4 蜂毒素对皮下移植瘤血管生成相关蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，NS 组中 bFGF、HIF-1α 和 NF-κB 表达率高，着色较深，而蜂毒素各组及TLD组中上述血管生成相关蛋白表达率低，着色淡。结果表明，蜂毒素低中高剂量组及 TLD 组 bFGF、HIF-1α 和 NF-κB 表达水平明显低于 NS 组 (P<0.01)。蜂毒素各组 bFGF 表达水平高于 TLD 组 (P<0.05或P<0.01)，说明 TLD 下调 bFGF 的作用较蜂毒素强；蜂毒素中高剂量组 HIF-1α 表达水平与 TLD 组比较差异无统计学意义 (P>0.05)，而低剂量组却明显高于 TLD 组 (P<0.05)；TLD 组 NF-κB 表达水平明显低于蜂毒素中低剂量组 (P<0.01)，而与蜂毒素高剂量组比较差异无统计学意义 (P>0.05)，见表 3。

表1 蜂毒素对裸鼠皮下移植瘤生长的影响 (±s，n=6)

表1 蜂毒素对裸鼠皮下移植瘤生长的影响 (±s，n=6)

组别裸鼠(只)肿瘤体积(mm3)治疗前治疗后相对肿瘤体积相对肿瘤增殖率(%)生理盐水组676．72±8．61690．06±94．699．06±1．45100．00沙利度胺组671．93±15．53317．19±90．614．40±0．89∗48．61蜂毒素低剂量组672．77±15．11324．86±88．514．42±0．58∗48．78蜂毒素中剂量组678．29±22．65268．24±93．253．47±0．97∗38．33蜂毒素高剂量组666．78±10．37202．35±78．083．06±1．23∗33．82

注：与生理盐水组比较，*为P<0.01

表2 2 裸鼠皮下移植瘤模型治疗前后体重变化及瘤体重量 (±s，n=6)

表2 2 裸鼠皮下移植瘤模型治疗前后体重变化及瘤体重量 (±s，n=6)

组别裸鼠(只)裸鼠体重(g)治疗前治疗后瘤重(g)抑瘤率(%)生理盐水组622．30±0．4022．17±0．660．79±0．210沙利度胺组622．25±1．3422．12±0．850．42±0．04∗46．25蜂毒素低剂量组622．30±1．1823．2±0．640．44±0．04∗44．64蜂毒素中剂量组623．27±0．7723．48±1．030．29±0．05∗△62．86蜂毒素高剂量组622．37±1．4023．58±2．040．21±0．05∗△△73．73

注：与生理盐水组比较，*为P<0.01；与沙利度胺组比较，△为P<0.05，△△为P<0.01

表3 蜂毒素对裸鼠皮下移植瘤 MVD 及 HIF-1α、bFGF、NF-κB表达的影响(±s,n=6)

表3 蜂毒素对裸鼠皮下移植瘤 MVD 及 HIF-1α、bFGF、NF-κB表达的影响(±s,n=6)

组别微血管密度HIF-1α表达bFGF表达NF-κB表达生理盐水组16．50±2．354．74±1．024．43±0．344．98±0．63沙利度胺组6．17±1．17∗0．95±0．10∗1．36±0．11∗1．65±0．81∗蜂毒素低剂量组11．33±1．86∗△△1．53±0．15∗△2．45±0．78∗△△2．79±0．29∗△△蜂毒素中剂量组9．17±1．17∗△△1．45±0．19∗△2．27±0．36∗△△2．71±0．66∗△△蜂毒素高剂量组6．67±1．21∗1．14±0．05∗△△2．10±0．27∗△2．26±0．56∗

注：与生理盐水组比较，*为P<0.01；与沙利度胺组比较，△为P<0.05，△△为P<0.01

3 讨论

肝癌是严重威胁人类健康的一大疾患，现有治疗方法虽然较多，但尚无一种方法能够单独适用于所有患者。因此，研发高效、低毒、特异性强的抗 HCC 新药已迫在眉睫。有研究发现，一些从天然药物中提取的小分子物质具有抗肿瘤血管生成作用，它们可以抑制血管内皮细胞增殖，诱导其凋亡[4]。蜂毒素是 1 种最新提取、纯化的小分子肽类物质，约占蜂毒干重的50%，由 26 个氨基酸组成[5]。近年来，我们实验室对蜂毒素从提取纯化到体内外抗肿瘤效果作了深入的研究。结果表明，蜂毒素在体外对骨肉瘤细胞U2OS、人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402、Hep-3B 等多种肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用，并可影响肿瘤细胞周期的正常移行，阻止 S 期细胞进入 G2/M 期[6～8]。本实验是在既往研究的基础之上，通过建立人肝癌 BEL-7402 裸鼠移植瘤模型，进一步评价蜂毒素体内抗肝癌作用，以及对 HCC 血管生成的影响。研究结果显示，蜂毒素可以有效抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，治疗组肿瘤重量及体积明显减小，并且呈剂量依赖性，在本实验所取剂量范围内未见蜂毒素具有明显不良反应。

肿瘤的生长和转移具有血管依赖性。新生血管为肿瘤组织提供充足的养分，而且发育不完善的微血管也为肿瘤细胞进入血液循环提供了便利。肿瘤微血管是肿瘤生长和转移的病理基础和必要条件，MVD 是评价肿瘤血管生成程度最客观的指标。有研究表明，MVD与肿瘤临床分期、病理分级、淋巴结有无转移，以及患者预后有密切关系[9]。MVD 越高，肿瘤侵袭性越强、转移越早、预后越差。在本次实验结束时，解剖裸鼠皮下移植瘤发现经蜂毒素处理后的肿瘤组织颜色较苍白，这可能与肿瘤微血管生成受到抑制有关。免疫组化检测结果显示，蜂毒素能够有效降低裸鼠皮下移植性肝癌组织 MVD，破坏肿瘤组织的新生血管。这提示，蜂毒素可以抑制HCC血管生成，降低肿瘤MVD，影响肿瘤组织血供，遏制肿瘤生长。

HCC 是典型的富血管恶性肿瘤，丰富的血管是其快速生长、早期转移及广泛浸润等生物学特性的物质基础[10]。HCC 的血管生成是 1 个由诸多调控因子参与的多步骤级链反应过程，而促血管生成因子对新生血管起着正向调节作用。 bFGF 是肿瘤组织中作用最强的促血管生成因子之一[11]，它与血管内皮细胞表面特异性受体结合后促进其增殖、分化、迁移。肿瘤在生长过程中，生长较快的中心区域很容易发生缺氧，由此导致大量缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 广泛表达，它可以结合于包括 bFGF 在内的诸多靶基因的相应位点，启动靶基因转录，诱导肿瘤血管的生成，增加肿瘤血管通透性[12]。在诸多肿瘤血管生成调控因子之间，核转录因子 NF-κB 起核心调控作用。有研究表明，NF-κB 在缺氧和酸性条件下被激活后可增强多种促血管生成因子的转录，两者协同促进肿瘤的血管生成[13]。当 NF-κB 表达受到抑制时，瘤体内的促血管生成因子表达降低。本研究结果显示，蜂毒素可有效下调促血管生成因子 HIF-1α 和 bFGF 的表达，随着药物剂量的增大抑制效果愈加明显。免疫组化检测结果表明，蜂毒素在抑制 HIF-1α 和 bFGF 表达的同时亦下调 NF-κB 表达，影响血管生成因子之间的协同关系，从而对裸鼠移植瘤的血管生成产生良好的阻断效应，进而抑制肝癌的生长。

综上所述，蜂毒素具有抑制裸鼠皮下移植性肝癌生长的作用，对肿瘤的血管生成产生较强的阻断效应，其作用机理可能与降低核转录因子 NF-κB 的活性，进而抑制 HIF-1α 的转录，影响 bFGF 等促血管生成因子的表达有关，但对其具体作用机制尚有待于进一步研究。

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