种间对比研究方法阐明解耦联蛋白与最大寿命的关系

王春明 郑荣梁 (兰州大学生命科学学院生物物理研究所,甘肃 兰州 730000)

活性氧作为氧自由基及其衍生物是体内最常见的自由基类物质,发挥着重要的生物作用。体内生成活性氧的源头是线粒体,线粒体活性氧产率与动物最大寿命负相关,线粒体解耦联蛋白 (uncoupling protein,UCP)能降低线粒体活性氧产率。因此,UCP很可能具有延缓衰老的作用,且可能是寿命的决定性因素。目前,探索 UCP与寿命关系的研究虽然很多,但结果相互矛盾。因此,本文拟提出应用种间对比研究方法阐明这一问题。

1 线粒体活性氧产率与动物最大寿命负相关

对比研究为衰老的自由基理论提供了重要证据,线粒体活性氧产率与最大寿命负相关的研究主要有：①5种蝇胸飞行肌线粒体活性氧产率与其寿命负相关〔1〕;②哺乳动物肝、肾和心肌线粒体活性氧产率与其最大寿命负相关〔2,3〕;③鸟类寿命远高于鼠,其线粒体活性氧产率远低于鼠〔4,5〕;④亲缘关系较近的两种小鼠M.m usculus和 P.leucopus,者寿命仅是后者的一半,短寿鼠线粒体超氧阴离子自由基 (O2)和 H2O2产率分别比高寿鼠多 48%～74%和 300%～500%〔6〕。

对比研究还解决了衰老的代谢率理论所不能解释的矛盾现象。衰老的代谢率理论一直在衰老研究领域占有重要地位,认为寿命与代谢率呈负相关。但有些动物寿命不符合这个学说。比如小鼠M.m usculus的代谢率低于 P.leucopus,但是前者寿命反而小于后者〔6〕;鸟类和灵长类的寿命都远高于依据其代谢率推断的预期值〔7〕。例如：鸽的代谢率为 465 L O2/g,远高于大鼠 28 L O2/g,但鸽的寿命 (35年)却远长于大鼠 (4年)〔8〕。而衰老的自由基理论根据线粒体自由基产率这个指标完满地解释了上述现象。对比研究发现,若用单位耗氧量生成自由基及其衍生物的量来衡量(常以线粒体产生 H2O2作为广义的自由基的代表),消耗同样多的氧,鸽线粒体产生的 H2O2仅为大鼠的 1/10,这正好对应了鸽的寿命约为大鼠寿命 10倍的现象〔4〕。可见,不论种内,还是种间对比研究,都表明线粒体自由基产率与寿命负相关。Barja曾对这类对比研究的结果有过比较系统的总结〔9〕。莫斯科国立大学的 Skulachev教授曾于 2004年在 Aging Cell杂志发表文章,专门讨论了 Barja等人的鸟鼠对比研究成果〔10〕。

但是,同样是线粒体,为什么它们的活性氧产率如此不同呢?针对这一问题,Lass等曾报道 9种哺乳动物 (小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、山羊、绵羊、牛和马)心肌线粒体生成 O·-2的量与其所含辅酶 Q(CoQ)同族体 CoQ9含量正相关,与 CoQ10量负相关,但是他们同时却发现并不能把不同哺乳动物线粒体 O·-2产量的差异归因于 CoQ9和 CoQ10量的不同〔11〕;后续研究还发现,补充 CoQ10也并不能增强动物抗氧化能力及延长寿命〔12〕。因此,CoQ是否能合理地解决前述问题尚需更多证据。可见,自由基理论在线粒体及其产生的活性氧水平上似乎完满地解释了决定衰老和寿命的根本原因,然而其更深层次的机制,即到底是什么决定了线粒体在活性氧产率方面存在如此大的差异,却依然有待深入探索。近年来,新的线粒体内膜 UCP同源蛋白的发现让人们看到了解决这一问题的曙光。

2 UCP降低线粒体自由基产率

UCP是一类位于线粒体内膜的跨膜蛋白。哺乳动物共含有 5种同源蛋白,它们是 UCP1～UCP5〔13,14〕。这 5种 UCP在动物体内的分布和表达具有组织特异性。UCP1存在于褐色脂肪组织;UCP2的分布最为广泛,其 mRNA表达水平在不同器官中差异较大,例如脾脏中 UCP2表达很高,而肝脏中较低;UCP3主要存在于骨骼肌和心肌中;UCP4和 UCP5主要在大脑中〔13～16〕。近年来 ,在线虫、果蝇、鱼类、鸟类、爬行类甚至植物中也相继发现了哺乳动物 UCP的同源蛋白〔13,14,17,18〕。

UCP1在褐色脂肪组织中负责非寒战性产热,对冬眠动物和新生儿体温维持起重要作用〔15,16〕。其他 4种 UCP,尽管它们的基因序列与 UCP1相比同源性很高,同属于 UCP家族,但其生理功能尚无定论。它们都具有使呼吸链质子回流,使氧化磷酸化轻微解耦联,进而降低线粒体自由基生成的作用。UCP的这一功能恰恰受到了自由基的激活〔19〕,即 UCP对线粒体自由基的生成具有反馈性抑制作用。2008年,Nature杂志报道胃内产生的生长素释放肽 ghrelin对神经元发挥作用的机制就在于UCP2降低了自由基的产生〔20〕。2009年 Jiang等发现 UCP在运动过程中表达升高,可能起到保护运动造成的氧化胁迫对线粒体的损伤作用〔21〕。

UCP降低线粒体自由基产率的工作原理见图1：呼吸链的电子传递在线粒体内膜两侧建立了跨膜质子梯度 (trans-membrane proton gradient,△pH)和线粒体膜电位 (mitochondrial membrane potential,△Ψm),△pH和 △Ψm的升高,促进了 O·-2的生成;而 UCP可以把质子从膜间隙流入基质,从而使△pH和△Ψm降低,使氧化磷酸化轻微解耦联,降低自由基的生成。也可以这样形象地理解：UCP是一个巧妙的设计,它就像大自然安装在线粒体内膜的安全阀一样,当线粒体产生过多自由基而具有危害时,UCP就被激活而降低自由基的生成,从而减少氧化性损伤。

图1 解耦联蛋白降低线粒体自由基生成示意图

3 UCP与寿命关系研究的现状和困境

线粒体是正常生理条件下细胞内自由基的主要来源,由它产生的自由基对细胞损伤的积累导致了衰老,并影响寿命的长短〔22〕。UCP既然从源头上调控着自由基的产生,其对衰老和寿命的影响就是本质性的。从这个意义上来说,UCP可能是决定寿命的原初分子。

UCP与寿命关系的研究才刚刚起步〔23,24〕。2005年,Fridell等报道把人UCP2基因转入果蝇的神经系统后,果蝇寿命延长了 10%～30%〔25〕;他们随后把果蝇体内 DmUCP5基因敲除后,在食用低热量食物情况下,比野生型果蝇的寿命还要长,而在食用高热量食物时则无差别〔26〕。前一个研究发现 UCP有利于寿命的延长,但是第二个研究却发现 UCP基因的敲除却并没有使果蝇寿命缩短。这表明敲除果蝇整体的 DmUCP5基因对果蝇寿命的影响比只在神经系统中过表达 UCP2基因更复杂。更有甚者,Humphrey等 2009年报道把人 UCP3基因 (hUCP3)分别转入果蝇整体、泛神经元以及神经分泌细胞〔27〕。结果发现,果蝇整体低表达 hUCP3对线粒体的质子内流无影响,在泛神经元中高表达 hUCP3则增加了质子内流,在神经元内的中度表达可使雄性果蝇寿命稍微延长,但是在神经组织中的高表达却造成果蝇寿命的缩短。分析发现,人为的基因表达对转基因果蝇造成的影响是多方面的,神经组织高表达 hUCP3的结果造成了胰岛素样多肽水平的升高,这可能与寿命的缩短相关联。这一研究结果也告诫人们,试图应用基因操作方法通过高表达UCP在增大质子内流的同时,造成的影响可能会是多方面的,不一定会得到延长寿命的预期结果。因此,在研究 UCP与寿命的关系时,基因操作的方法并不适用。线虫实验也发现,敲除 CeUCP-4基因后并没有影响到线虫的抗氧化能力和寿命〔28〕。这个结果似乎也不支持 UCP与寿命之间存在联系。但是,2009年 Lemire等人用线粒体解耦联剂氰氯苯腙 (CCCP)却证实线粒体的解耦联作用可以延长线虫的寿命〔29〕。因此,前述 CeUCP-4基因敲除不影响线虫寿命的报道很可能是基因敲除方法影响了线虫其他基因表达而造成的。这也进一步证明了基因操作方法在UCP与寿命关系研究中的局限性。2006年12月第一篇应用基因操作手段研究 UCP与哺乳动物寿命的文献发表在 Science上〔30〕,作者用转基因的方法使小鼠下丘脑神经元细胞过表达 UCP2,导致转基因鼠体温下降,最终延长了实验动物的寿命。这一工作为UCP2能够调控高等生物体寿命提供了直接证据。2009年Andrews等详细报道了UCP2调控小鼠寿命的现象〔31〕。他们发现,UCP2的缺失使野生型小鼠寿命缩短,而且 UCP2表达水平与线粒体特有的超氧化物歧化酶(SOD-2)突变小鼠的存活率正相关。因此认为 UCP2有助于寿命的延长,进一步证实了小鼠 UCP2对其寿命的重要作用。特别值得一提的是,他们同时报道了大鼠不同组织的线粒体解耦联能力强于小鼠的现象,似乎预示了大鼠寿命高于小鼠。这说明同行中已经有人注意到了对比研究方法在 UCP与寿命关系研究中的潜在作用。

以上实验在肯定UCP2延长寿命作用的同时,也反映出所用实验方法存在的缺陷。在所用的 3类动物模型 (果蝇、线虫、小鼠)中,果蝇和小鼠特定神经元过表达 UCP可延长寿命〔25,30〕,但果蝇整体过表达或某些组织过表达 UCP的结果却很复杂〔27〕,而果蝇和线虫中敲除内源 UCP基因却不影响寿命〔26,28〕。这一方面说明 UCP过表达的效果具有组织特异性,也说明 UCP敲除的影响有可能被其他机制所补偿,比如,UCP缺失造成的对活性氧调节功能的损害,可通过其他抗氧化机制得到补偿;还有可能是基因操作方法本身影响到了其他基因的功能,最终掩盖了 UCP基因敲除对寿命的影响。不仅如此,基因操作方法在研究哺乳动物寿命方面存在难以弥补的缺陷。例如,小鼠寿命较短,用基因操作的方法来研究尚需几年时间,对于更长寿命的哺乳动物用基因操作的方法研究寿命就更难了。因此,种间对比研究在不干扰实验动物遗传背景的前提下,更适合阐明哺乳动物UCP与寿命的关系。

4 种间对比研究方法应用于UCP与寿命关系研究

种间对比研究已经揭示了线粒体活性氧产率与最大寿命负相关的规律,推测 UCP与寿命有关的观点也正是基于这一规律。我们通过对金丝雀和小鼠心肌线粒体的对比研究,发现前者 UCP活性及蛋白表达水平分别是后者的 3倍和 4倍,基本与金丝雀心肌线粒体自由基产率低的现象相一致〔32〕。这一结果对于种间对比研究方法应用于 UCP与寿命关系研究提供了很好的支持。

总之,衰老是一个长期复杂的过程,是受多因素影响和决定的。对UCP功能的深入研究有利于揭开衰老和寿命的部分奥秘。

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