维生素 C在小鼠小肠高铁吸收中的作用

2011-01-06 09:07郭晓强高姗姗段相林
中国老年学杂志 2011年2期
关键词:结合力饱和度机体

郭晓强 高姗姗 丁 卉 段相林

(河北师范大学生命科学学院 河北省动物生理生化与分子生物学重点实验室,河北 石家庄 050016)

铁是生物发育所必需的元素之一,参与物质代谢、红细胞生成和细胞分裂等多重生物学功能〔1〕,它的缺乏是贫血发生的重要原因。然而,铁还参与了导致机体损伤的活性氧物质生成,随着年龄增长组织出现的铁沉积可造成机体衰老和多种退行性疾病的发生〔2〕,因此维持机体内稳态尤其是高铁状态下抑制铁吸收具有十分重要的意义〔3〕。维生素 C可促进铁的吸收,是补铁常用辅助品之一,然而维生素 C作为老年人提倡补充的化合物是否可减少铁沉积尚缺乏实验证据。食物中的三价铁主要是在十二指肠被吸收,首先把三价铁还原为二价铁,然后再与二价金属转运蛋白 1(divalentmetal transporter 1,DMT1)结合并转运至吸收细胞内,进入吸收细胞内的铁除了满足吸收细胞本身需要外,其余的铁由铁转运蛋白 (ferroportin,FPN)释放出吸收细胞并进入血循环,经血循环供机体各器官组织应用〔4〕。本实验研究以成年小鼠为材料,探索维生素 C对十二指肠携带铁应答元件 (iron-responsive element,IRE)的 DMT1(DMT1+I RE)和 FPN的 mRNA表达影响。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 实验用 3月龄昆明小鼠 (清洁级)购自河北省实验动物中心,体重 35 g左右;Trizol试剂盒、苜蓿花叶病毒 (AMV)逆转录酶、Taq酶、维生素 C和焦碳酸二乙酯 (DEPC)等均购自上海生工,其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和处理 15只小鼠分为 3组,分别用正常铁饲料 (含 0.5 g/kg乳酸亚铁)、高铁饲料 (含 2g/kg乳酸亚铁)和高铁饲料加维生素 C(含 2 g/kg乳酸亚铁和 0.8 g/kg的维生素 C)喂养 1 w(正常饮水),饲料其他成分均相同。

1.2.2 取材 取材前 12 h禁食以减少小鼠肝糖原积累。腹腔注射 0.4%戊巴比妥钠麻醉小鼠后剖开腹腔,心脏取血以制备血清测定血清铁和总铁结合力,使用 DEPC处理的生理盐水心脏灌流,完毕后取适量十二指肠放入 Trizol中供 RNA提取。

1.2.3 小鼠血清铁和总铁结合力测定 使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒按照说明书完成,然后计算转铁蛋白饱和度 (血清铁 /总铁结合力)。

1.2.4 小鼠十二指肠 DMT1+ IRE和 FPN的 mRNA半定量RT-PCR检测 十二指肠黏膜首先进行总 RNA提取和浓度测定,取相同量总 RNA应用逆转录获得 cDNA后对 DMT1+IRE、FPN和肌动蛋白 (β-actin)进行 PCR扩增 34个循环 (94℃变性30 s,58℃退火 40 s,72℃延伸 1 min),将 PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,所得结果用凝胶成像系统扫描并计算吸光度值。实验中所用基因的 PCR引物均为上海生工生物工程技术有限公司合成,其序列分别为:DMT1+IRE:正义链为 TCCTGGACTGTGGACGCT;反义链为 GGTGTTCAGAAGATAGAGTTCAGG;FPN:正义链为 ACAAACAAGGGGAGAACGC;反义链为ATGACGGACACATTCTGAACCA;β-actin:正义链为 AGCCATGTACGTAGCCATCC;反义链为 TTTGAGGTCACGCACGATTT。

1.3 统计学分析 数据以 x ±s表示,应用 SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 维生素 C对高铁饮食增加小鼠 DMT1+IRE和 FPN mRNA表达的抑制作用 半定量 RT-PCR检测表明,高铁饮食相对于正常铁喂养明显增加了小鼠DMT1+IRE和 FPN的mRNA表达 (P<0.05),在添加维生素 C后,这种增加效应明显受到抑制 (P<0.05)。见图1。

图1 维生素对高铁状况下肠铁吸收蛋白基因表达的影响

2.2 维生素 C对高铁饮食血清铁和转铁蛋白饱和度的影响相对于正常铁饮食,高铁饲养可显著升高小鼠血清铁和转铁蛋白饱和度 (P<0.05),而添加维生素 C后可显著减少高铁饮食引起的血清铁和转铁蛋白饱和度升高 (P<0.05)。见表1。

表1 维生素 C对高铁饮食小鼠血清铁和总铁结合力的影响

表1 维生素 C对高铁饮食小鼠血清铁和总铁结合力的影响

与正常组比较:1)P<0.05;与高铁组比较:2)P<0.05;下图同

指标 正常铁 高铁 高铁 +维生素 C血清铁 (μg/dl) 1.41±0.26 2.15±0.481) 1.71±0.282)转铁蛋白饱和度(%) 59.2±6.3 78.2±6.71) 66.4±7.22)

3 讨 论

已知,缺铁情况下维生素 C可促进铁吸收,因此常用作补铁辅助药物〔5〕,然而研究还发现维生素 C拥有减少高铁诱发的氧化损伤作用〔6〕,这种作用可能有两种机制,一种是作为抗氧化试剂的维生素 C通过还原作用来实现〔7〕,另一种是维生素 C本身调节铁代谢相关基因的表达以减少铁吸收〔8〕。本研究表明,高铁饲料可促进小鼠十二指肠 DMT1+I RE和转铁蛋白的表达,从而增加了铁的摄入,因此机体血清铁和 FPN饱和度增加,机体损伤增多,如高铁饮食小鼠常表现出发育迟缓,反应力下降甚至死亡等。在高铁饲料中补充维生素 C后,高铁引起的DMT1+IRE和 FPN的 mRNA表达升高效应明显受到抑制,从而铁吸收减少,血清铁降低,这说明高铁状态下维生素 C可通过抑制肠铁吸收而保护机体免受损伤。

最近发现低氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factors-2α,H IF-2α)在肠铁吸收过程中发挥了重要作用〔9〕。低铁状态下,H IF-2α可促进 DMT1+IRE和 FPN的基因表达以增加铁的吸收,而铁过载引起 H IF-2α泛素化修饰并被蛋白酶体降解,DMT1和 FPN表达减少而抑制铁吸收〔10〕。H IF-2α泛素化修饰前需要首先羟基化,该过程有多种辅助因子的参与,如低氧、高铁、α-酮戊二酸及维生素 C等〔11〕,因此高铁状态下维生素 C的存在有利于 H IF-2α最终降解和 DMT1的表达抑制,减少铁吸收从而更好的维持机体铁稳态。

本实验初步阐明了维生素 C在高铁状态下对肠铁吸收的抑制作用,一方面有利于对铁稳态调节机制的理解,另一方面在将来对缓解老年人铁过载引起的机体损伤方面也有重要裨益。

1 Andrews NC.Forging a field:the golden age of iron biology〔J〕.Blood,2008;112(2):219-30.

2 Xu J,Knutson MD,Carter CS,et al.Iron accumulation with age,oxidative stress and functional decline〔J〕.P Los One,2008;3(8):2865.

3 Hentze MW,muckenthaler MU,Andrews NC.Balancing acts:molecular control of mammalian iron metabolism〔J〕.Cell,2004;117(3):285-97.

4 Anderson GJ,Frazer DM,McLaren GD.Iron absorption and metabolism〔J〕.Curr Opin Gastroenterol,2009;25(2):129-35.

5 Péneau S,Dauchet L,Vergnaud AC,et al.Relationship between iron status and dietary fruit and vegetables based on their vitamin C and fiber content〔J〕.Am J Clin Nutr,2008;87(5):1298-305.

6 Duarte TL,Jones GD.Vitamin C modulation of H2O2-induced damage and iron homeostasis in human cells〔J〕.Free Radic Biol Med,2007;43(8):1165-75.

7 Rehman A,Collis CS,YangM,et al.The effectsof iron and vitamin C cosupplementation on oxidative damage to DNA in healthy volunteers〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1998;246(1):293-8.

8 Kang JS,Cho D,Kim YI,et al.Sodium ascorbate(vitamin C)induces apoptosis inmelanoma cells via the down-regulation of transferrin receptor dependent iron uptake〔J〕.J Cell Physiol,2005;204(1):192-7.

9 郭晓强,高姗姗,李 会,等 .缺氧诱导因子-2α与肠铁吸收〔J〕.生命的化学,2009;29(6):893-7.

10 Mastrogiannaki M,Matak P,Keith B,et al.HIF-2 alpha,but not HIF-1alpha,promotes iron absorption in mice〔J〕.J Clin Invest,2009;119(5):1159-66.

11 Kaelin WG Jr.The von Hippel-Lindau tumour suppressor protein:O2sensing and cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2008;8(11):865-73.

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