复合诱变选育乳链菌肽高产菌株

李海娜，苏移山，张晓元，朱希强，臧恒昌，郭学平

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院，山东 济南 250101)

复合诱变选育乳链菌肽高产菌株

李海娜1，2，苏移山2，张晓元2，朱希强1，2，臧恒昌1，郭学平1，2

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院，山东 济南 250101)

目的 选育乳链菌肽高产菌株。方法 以乳酸链球菌ATCC11454为出发菌株，采用紫外线、微波和亚硝酸钠对其进行复合诱变处理，并结合乳链菌肽抗性筛选选育出高产乳链菌肽的菌株。结果 通过选育获得一株乳链菌肽的高产菌株Nis-123，乳链菌肽产量为5 250 U/mL，较出发菌株提高了4.3倍。传代实验证明该菌株遗传性稳定。结论 紫外线、微波和亚硝酸钠复合诱变结合乳链菌肽抗性选育可以提高乳酸链球菌的产肽能力。

复合诱变;乳链菌肽;选育

乳链菌肽(nisin)，又称乳酸链球菌肽(素)，是乳酸链球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)产生的一种多肽，对多种革兰阳性菌，包括对食品造成严重危害的许多腐败菌有强烈的抑制作用，是联合国粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)批准使用的食品防腐剂。近年来，随着高纯度nisin的研制及与螯合剂的联合使用，其在医药领域的应用日益广泛［1］。nisin可明显抑制对多种药物都具有耐药性的肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等病原菌，有可能解决此类耐药性问题。此外，nisin作为药物治疗胃溃疡取得了显著疗效，使其生物合成倍受关注［2-3］。自然界中分离得到的nisin生产菌株生物合成nisin的量一般较低，达不到工业化生产的要求，必须通过菌株改良，提高nisin的产量。复合诱变是普遍采用的提高微生物生产性能的主要方法，通常是指两种或多种诱变剂先后或同时作用于微生物，或同一种诱变剂重复作用于微生物。普遍认为，复合诱变具有协同效应，如果诱变剂合理搭配使用，复合诱变较单一诱变效果好。同时，根据乳酸链球菌中nisin产生(nip+)、nisin抗性(nisr)以及调控基因紧密连锁而容易发生共突变的理论［4］，利用nisin抗性突变作为筛选标记，可以进行nisin高产菌株的定向选育。姜丽艳等［5］已采用硫酸二乙酯诱变结合nisin抗性筛选得到一株nisin高产菌株，证明该定向选育的方法有较好的筛选效果。本研究采用紫外线、微波和亚硝酸钠对菌株进行复合诱变，筛选高产nisin的菌株。

1 材料

1.1 菌种

出发菌株:乳酸链球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)ATCC11454，购于美国标准菌种收藏所;检测菌株:藤黄微球菌(Micrococcus luteus)NCIB 8166，购于山东省药品检验所。

1.2 培养基

种子培养基:M17培养基中加0.5%葡萄糖，115℃灭菌20 min。

液体发酵培养基:蔗糖30 g/L，牛肉膏30 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO410 g/L，NaCl 2 g/L，pH值为6.8，121℃灭菌20 min，固体培养基中添加琼脂粉20 g/L。

检测菌培养基:蛋白胨8 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖 5 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，NaCl 5 g/L，吐温20 10 mL/L，琼脂粉 8 g/L，pH 值为 7.2 ～7.4，115℃灭菌20 min。

1.3 nisin 标准品

Sigma N5764，比活 1 000 U/mg。

2 方法

2.1 紫外线诱变

出发菌株单菌落接种于装有种子培养基50 mL的250 mL锥形瓶中，30℃，100 r/min振荡培养至对数生长后期;6 000 r/min离心5 min，弃上清液，所得菌体用生理盐水悬浮，调整菌体浓度为108cfu/mL。将菌悬液3 mL和磁力搅拌棒放入直径为75 cm的无菌培养皿中，置于30 W紫外灯下，垂直距离30 cm照射。处理后的菌悬液涂于抗性平板(固体培养基中加入一定量的nisin标准品)，30℃倒置培养。

菌悬液分别用紫外线处理 0，10，15，20，25，30，40，50 s后，在红光下稀释不同梯度涂板，30℃培养30 h，计算致死率。致死率=(未经诱变的平板菌落数－诱变后的再生菌落数)/未经诱变的平板菌落数×100%。

2.2 微波诱变

将紫外线诱变得到的高产菌株单菌落接种液体培养基培养至对数生长后期，直接放入微波炉中以高强度微波(850 W)处理，每隔10 s取出冷却以消除热效应。处理后的菌液涂于抗性平板，30℃倒置培养。

菌悬液分别用微波高火处理 0，10，20，30，40，50 s后，稀释至不同梯度涂板，30℃的条件下培养30 h，计算致死率。

2.3 亚硝酸钠诱变

将微波诱变得到的高产菌株单菌落接种培养至对数生长后期，离心，弃去上清液，所得菌体用0.1 mol/L，pH 4.6的醋酸缓冲液洗涤并悬浮，调整菌体浓度为 108cfu/mL。将菌悬液、醋酸缓冲液和1 mol/L NaNO2溶液(1∶1∶1)加入到已灭菌的密闭离心管中，30℃水浴处理。诱变结束后立即用0.07 mol/L磷酸氢二钠溶液(pH 8.6)8 mL终止反应。处理后的菌液涂于抗性平板，30℃倒置培养。

菌悬液分别用亚硝酸钠溶液处理0，10，20，30，40，50 min，取样稀释涂平板，30℃的条件下培养30 h，计算致死率。

2.4 抗性平板中nisin浓度的确定

将培养好的菌悬液涂布在含有不同浓度nisin的抗性培养基上，30℃培养，观察菌体的生长情况，确定合适浓度的抗性平板。

2.5 高产菌株的筛选

采用双层平板法，平板下层倒入含有检测菌的检测培养基15 mL，水平放置，待凝固后再倒入平板分离培养基(同液体发酵培养基，加1.2%的琼脂)5 mL，涂布一定稀释度的处理菌液后，30℃培养24 h，菌落周围出现透明的抑菌圈，挑取抑菌圈较大的菌落进行复筛。

初筛菌株逐个接入发酵培养基，30℃，100 r/min振荡培养30 h，测定发酵液中nisin效价。经反复筛选，选出nisin效价较高的突变菌株。

2.6 发酵液nisin效价的测定方法

用0.02 mol/L盐酸将发酵液稀释到其抑菌圈直径在5～100 U/mL的nisin标准液的抑菌圈直径之间(效价在5～100 U/mL时，效价对数值与抑菌直径存在直线关系)，沸水浴加热3 min，9 000 r/min离心3 min，取上清液与nisin标准溶液分别加入检测平板的各个孔洞内，30℃培养20 h左右，测定抑菌圈直径，并由此算出发酵液的效价。

2.7 菌株稳定性实验

筛选得到的菌株接入斜面培养基中，30℃培养24 h后作为F1代，从F1代斜面转接至斜面培养基，30℃培养24 h后作为F2代，同样方式连续传代20次。每培养3代取斜面，接种到液体发酵培养基中培养30 h后测定的抑菌圈大小，考察其抑菌活性的传代稳定性。

3 结果

3.1 抗性平板中nisin浓度确定结果

经验证出发菌株nisin抗性为2 000 U/mL。在诱变过程当中，由于共突变的发生，菌株对nisin的抗性也产生正突变而逐步有所提高。在反复实验过程中，紫外诱变抗性平板中nisin的最大抑制浓度为9 000 U/mL，微波诱变中最大抑制浓度为15 000 U/mL，亚硝酸钠最大抑制浓度为18 000 U/mL。

3.2 紫外线诱变致死率的测定

结果见图1A。20，25，30和50 s时的致死率分别为 73.0%，82.2%，93.1% 和 100%。据报道［6］，70%～80%为紫外线诱变育种的最适致死率，因此将20 s作为紫外重复诱变的处理时间。

图1 乳酸链球菌紫外诱变(A)、微波诱变(B)和亚硝酸钠诱变(C)致死率Fig.1 Effect of ultraviolet(A)，microwave(B)and sodium nitrite(C)on cell mortality

3.3 紫外线诱变选育的结果

在含nisin 9 000 U/mL的抗性平板中得到4株产量较高的突变菌，并选择产量最高的UV-8进行下一轮的微波诱变。结果见表1。

表1 紫外线诱变选育结果Tab.1 Results of screening by UV treatment

3.4 微波诱变致死率的测定

结果见图1B。40，50，60和70 s时致死率分别为74.4%，85.6%，95.0% 和 100%，结合文献报道［7］，微波诱变的处理时间控制在50 s。

3.5 微波诱变选育的结果

在nisin含量为15 000 U/mL的抗性平板中选取到2株产量较高的突变菌，结果见表2。

表2 微波诱变选育结果Tab.2 Results of screening by MW treatment

3.6 亚硝酸钠诱变致死率的测定

选择MW-109进行亚硝酸钠诱变，结果见图1C。40，50，60 和70 min 时，致死率分别为 68.5%，82.2%，96.3%和 100%。据报道［8］，亚硝酸钠诱变致死率在80%左右正突变率最高，因此将50 min作为亚硝酸钠重复诱变的诱变时间。

3.7 亚硝酸钠诱变选育的结果

在nisin含量为18 000 U/mL的抗性平板中得到3株产量较高的突变菌，其中菌株Nis-123产量最高，效价已达5 250 U/mL。结果见表3。

表3 亚硝酸钠诱变选育结果Tab.3 Results of screening by NaNO2 treatment

3.8 菌种稳定性实验结果

选择产量最高的菌株Nis-123进行菌种稳定性实验，结果见表4，突变株Nis-123产量稳定，未发生明显的回复突变。

表4 nisin高产菌株Nis-123稳定性考察结果Tab.4 Experimental results of nisin-producing stability by Nis-123

4 讨论

以乳酸链球菌素ATCC11454为出发菌株，经紫外线、微波、亚硝酸钠诱变，nisin抗性筛选的定向选育方法得到的高产菌株Nis-123，产nisin效价达到5 250 U/mL，比出发菌株提高了4.3倍，传代实验证明其稳定性较好，达到工业化生产的要求。

Nisin高产菌株的获得主要是传统的随机诱变育种，该方法具有周期长，工作量大的缺点，得到的高产菌株虽产量有所提高，但满足工业生产要求的不多。推理选育在对产物合成途径有一定了解的基础上，设计最优的筛选方案，缩短筛选时间，提高工作效率。本实验采用nisin抗性筛选的推理选育方法，快速、有效，值得进一步推广。

紫外诱变是一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和方法简便等优点，是诱变选育的一种主要方法，在实验中应用的非常普遍。但采用紫外线和其他诱变因子进行复合诱变，往往会取得更理想的诱变效果。本实验采用紫外、微波及亚硝酸钠复合诱变选育得到的高产菌株，其效果明显优于单因子诱变。随着对nisin的生物合成途径和代谢调节理论的认识的加深，利用基因工程技术对nisin生产菌进行改良，获得nisin高产菌株也将是nisin研究、开发的重点。

［1］焦瑞身.微生物工程［M］.北京:化学工业出版社，2003:522-532.

［2］Severina E，Severin A，Tomasz A.Antibacterial efficary of nisin against multidrug-resistant Gram-positive pathogens［J］.J Antimicrob Chemother，1998，41(3):341-347.

［3］Brumfitt W，Salton M R J，Hamilton-Miller JM T.Nisin，alone and combined with peptidoglycan-modulating antibiotics:activity against methicillin resistant Staphylococcus aureus and vancomycinresistant enterococci［J］.J Antimicrob Chemother，2002，50(5):731-734.

［4］周绪霞，李卫芬.乳链菌肽生物合成及其调控［J］.中国食品学报，2005，5(1):86-92.

［5］姜丽艳，闫国栋，张宏宇，等.乳链菌肽高产菌株的推理选育［J］.科研开发，2009，25(4):38-40.

［6］朱会霞，孙金旭.紫外诱变筛选Nisin高产菌株的研究［J］.酿酒科技，2008，29(11):26-28.

［7］申 斐，张贺迎，武金霞.微波诱变对乳酸乳球菌Nisin产量的影响［J］.食品研究与开发，2006，27(11):26-28.

［8］梁 亮，邱雁临，许进涛.紫外线与亚硝酸钠复合诱变选育L-组氨酸产生菌［J］.微生物学杂志，2008，28(2):27-29.

Breeding of high-yield strain of nisin by compound mutation

LI Hai-na1，2，SU Yi-shan2，ZHANG Xiao-yuan2，ZHU Xi-qiang1，2，ZANG Heng-chang1，GUO Xue-ping1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

Purpose To screen a high-yield strain of nisin.Methods With Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454 as the starting strain，the mutant with high-yield nisin was bred after ATCC11454 was treated by the compound mutation of ultraviolet，microwave and sodium nitrite and the resistance screening.Results The nisin yield of the selected strain Nis-123 was 5 250 U/mL，increasing by 4.3 times compared with the starting strain.The passages showed that the heredity character of the mutant strain was stable.Conclusion The yield of nisin can be elevated through the compound mutation of ultraviolet，microwave，sodium nitrite and the resistance screening.

compound mutation;nisin;breeding

TQ465.92

A

1005-1678(2011)05-0378-04

2010-04-20

李海娜，女，硕士研究生，制药工程专业;郭学平，通信作者，研究员，硕士生导师，Tel:0531-82685555，E-mail:guo-xp@139.com。