乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达

田文静，罗学刚，吕丽慧，倪 萌，井晓兰，张同存

(1.天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457;2.武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430065;3.天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达

田文静1，罗学刚1，吕丽慧1，倪 萌1，井晓兰1，张同存2，3

(1.天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457;2.武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430065;3.天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

目的 构建瑞替普酶(rPA)大肠杆菌基因工程菌，优化乳糖诱导表达条件，并获得活性重组蛋白。方法通过PCR扩增得到rPA编码基因，将该基因片段克隆到载体pET40b中，转化E.coli BL21。优化确定乳糖诱导浓度、时间、温度等参数，将诱导表达后获得的菌体细胞通过超声破碎裂解后利用镍柱亲和色谱进行分离纯化，重组目的蛋白经Xa因子切割去除DsbC融合标签后释放获得rPA产物，最后利用纤维蛋白平板法对其溶栓活性进行检测。结果 rPA重组质粒构建成功，利用终浓度30 mmol/L的乳糖于30℃诱导5 h可以获得很好的表达效果，重组蛋白的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近;经纯化后的rPA目的蛋白可表现出明显的溶栓活性。结论 本研究为进一步利用大肠杆菌系统表达生产高活性重组rPA提供了一定的参考依据。

瑞替普酶;DsbC;乳糖;大肠杆菌;表达

由血管栓塞引发的各类心血管疾病严重威胁人类生命，是造成死亡和病残的主要原因之一。全世界每年心血管病患者多达1 300万，其中急性心肌梗死(AMI)死亡率高达30%。据统计，在美国每年大约有90万人患有急性心肌梗死，死亡人数达到22.5万，其中有一半左右未得到治疗就已死亡［1］。

组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是人体内正常存在的特异性纤维蛋白溶解物，被用于临床血液栓塞病的治疗。然而，由于tPA的体内半衰期极短，只有3～5 min，治疗时所需剂量高达50～100 mg，因而在使用时不仅费用昂贵，而且增加了周身纤溶性出血的危险性［2］。对tPA分子进行改造，延长其半衰期并增强其纤溶活性是克服这些缺点的主要途径之一。tPA的区域缺失性突变体——瑞替普酶(Reteplase，rPA)即是经过人为改造，由天然tPA的1～3位氨基酸和176～527位氨基酸组成的新型溶栓制剂，含羧基端的K2区和蛋白酶区，缺乏氨基端的F区、EGF区和K1区［3］。与tPA相比，rPA的半衰期延长为(14.4±1.1)min，其渗入血栓内的能力明显增强，用药后能快速起效，而引发出血不良反应的几率则大大降低，被认为是新一代可以替代链激酶和tPA的安全、有效的溶栓药物［4-6］。

rPA含有9对二硫键，因此如何在大肠杆菌表达体系中形成正确的空间构象，避免包涵体的形成使其可溶性表达，便成了利用大肠杆菌系统开发生产rPA的瓶颈［7］。在本研究中，我们将rPA的编码序列置于二硫键异构酶(Recombinant Disulfide Bond Isomerase，DsbC)信号肽及其基因序列之后构建成融合蛋白(DsbC-rPA)，使其可在大肠杆菌中获得较好的可溶性表达。同时，为了降低生产成本，本研究选择乳糖作为诱导剂，对表达条件进行了优化，为进一步建立高活性、低成本的rPA重组生产方法奠定了基础。

1 材料

E.coli DH5α 菌株、E.coli BL21菌株及 pET-40b质粒，均由天津市工业微生物重点实验室微生物菌种保藏管理中心提供，pMD18T-tPA质粒由天津科技大学李玉老师惠赠。

pfu DNA聚合酶、dNTPs、DNA快速纯化回收试剂盒为上海生工生物工程公司产品;各种限制性内切酶均为MBI公司产品;DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司;T4 DNA连接酶为Promega公司产品;琼脂糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、酵母提取物、琼脂粉和胰蛋白胨均为BBI公司产品;人纤维蛋白原购自上海莱士血制品公司;凝血酶为湖南一格制药有限公司产品。

2 方法

2.1 重组质粒pET40b-rPA的构建

根据tPA基因序列，设计扩增rPA编码序列的特异性引物。上游引物:5'-CGGGGATCCG ATCGAAGGTCGT TCTTACCAAGGAAACAGTG-3';下游引物:5'-GGGCTCGAGA TTA CGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3'。其中在上下游引物中分别引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点(下划线部分)。此外，为方便在后期切割去除DsbC融合标签，在上游引物中引入Ⅹa因子蛋白酶切位点(斜体部分)，同时，为了保证蛋白质翻译过程的正常终止，在下游引物中引入终止密码子(斜体部分)。以pMD18T-tPA质粒为模板，进行PCR反应:94℃预变性5 min后进行30次循环(94 ℃，45 s;64 ℃，45 s;72 ℃，1.5 min)，最后于72℃反应10 min。PCR产物和pET40b质粒经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后，用T4 DNA连接酶进行连接、转化E.coli感受态细胞。重组质粒经双酶切验证及测序分析结果正确后转到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中。

2.2 乳糖浓度、诱导时间和温度的优化

当菌液A600达到0.6～1.0时进行诱导表达，分别于25，30和37℃以不同的乳糖浓度(终浓度10，20，30，40，50 mmol/L)进行诱导表达，诱导 1，2，3，4，5，6 h时分别取样进行菌体浓度测定和蛋白表达量测定，每个实验至少重复2次，以确定适合菌株生长和目的蛋白表达的乳糖浓度、诱导时间和温度。最后再用最佳诱导条件与IPTG的诱导效果进行比较分析。

2.3 重组蛋白的分离纯化

超声波破碎菌体后离心，将上清蛋白样品加到装有预先用2-吗啉乙磺酸(MES)(50 mmoL/L，pH 6.1)溶液50 mL平衡过的10 mL强阴离子交换树脂UNOsphereQ的色谱柱中，用含有0.1 mol/L LiCl的 MES(25 mmoL/L，pH 6.1)溶液150 mL 梯度洗脱rPA蛋白，用部分收集器收集蛋白样品(1.5 mL/管)。纯化获得的融合蛋白利用Ⅹa因子切割去除DsbC标签后再次利用柱色谱进行分离纯化，从而获得rPA目的蛋白。

2.4 纤维蛋白平板法(FAPA)验证产物活性

用FAPA测定重组目的蛋白的体外溶栓活性。所有溶液均用磷酸盐缓冲液(PBS)配制。先称量纤维蛋白0.02 g后迅速加到装有PBS 5 mL的锥形瓶中，用枪轻轻吹吸，摇匀，放37℃培养箱预热，10 min左右即可溶解。接着取少量凝血酶放入装有PBS 1 mL的EP管，轻吹一下，放入37℃培养箱预热。最后用PBS7 mL溶解琼脂糖0.07 g，加热至沸腾，冷却至适合温度，加入纤维蛋白和凝血酶摇匀后倒入平板中。凝固后打孔，紫外灯下灭菌30 min。将样品加入孔中，37℃下培养12 h，观察溶栓圈产生情况［8］。

3 结果

3.1 重组质粒pET40b-rPA的构建

如图1所示，PCR反应后在1.1 kb处可见明显的特异性条带，片段大小与预期的一致。将此PCR扩增产物克隆到表达载体pET40b质粒DsbC下游，获得rPA重组质粒。重组质粒经Bam HⅠ及XhoⅠ双酶切验证后可见到明显的1.1 kb目的条带，进一步经测序证实目的基因序列、插入方向及开放阅读框均完全正确性，表明重组质粒pET-40b-rPA构建成功。

图1 pET40b-rPA重组质粒的构建Fig.1 Construction of pET40b-rPA plasmid

3.2 乳糖诱导最佳浓度的确定

诱导温度为30℃和诱导时间为5 h时，在重组菌生长至A600值为0.6时加入不同浓度的乳糖，使终浓度分别为 10，20，30，40，50 mmol/L，继续诱导4 h，取样进行SDS-PAGE电泳并与之前优化好的IPTG诱导条件(浓度为0.6 mmol/L)相比较，结果显示，当乳糖终浓度为30 mmol/L时目的蛋白的表达量最高，此后随着乳糖浓度的增高表达量反而有所下降。这可能是由于乳糖从胞外转移至胞内需要β-半乳糖苷透过酶的作用，这是一种主动运输的过程，高浓度的乳糖会造成菌体质子推动力的消耗，从而“分散”了菌体的能量［9］。当终浓度为30 mmol/L时不仅得到了较高的表达量而且菌体生物量很大，表明在此浓度时，菌体对乳糖的分配利用最为合理，既有效促进了生长又充分发挥了诱导效果，所以确定乳糖诱导最佳浓度为30 mmol/L。

3.3 乳糖诱导温度的确定

以已经确定的乳糖浓度(终浓度为30 mmol/L)，分别于25，30，37℃条件下诱导蛋白表达5 h时取样进行SDS-PAGE电泳，并与以前优化确定出的IPTG诱导条件(终浓度0.6 mmol/L)相比较，结果如图3所示。诱导温度为30℃时，利用乳糖诱导所获得的目的蛋白量与IPTG诱导表达量相当，表达情况优于另外两个温度，因此确定乳糖诱导最佳温度为30℃。

图2 不同乳糖浓度诱导表达情况Fig.2 Expression induced with different concentrations of lactose

图3 不同温度时乳糖诱导表达情况Fig.3 Expression induced with lactose at different temperature

3.4 乳糖诱导持续时间的确定

以已经确定的乳糖浓度(终浓度为30 mmol/L)于30℃下诱导表达，分别于诱导后1～6 h取样进行SDS-PAGE分析，并同时与IPTG的诱导条件(持续时间3 h)进行比较，以确定乳糖诱导的最佳时间，结果如图4所示。同一温度和乳糖浓度下，在1～5 h内，目的蛋白的表达量随时间延长逐渐最佳，但至6 h后增加量较少，即诱导表达5 h可在最少的时间内得到最大的诱导量，因此选定诱导时间为5 h。

3.5 乳糖最佳诱导条件与IPTG诱导效果的比较

为了比较乳糖与IPTG诱导的结果，选择乳糖诱导的最佳条件(诱导终浓度为30 mmol/L，诱导温度为30℃，诱导时间为5h)与本研究前期优化确定的IPTG最佳诱导条件(浓度0.6 mmol/L，温度25℃，时间3 h)对收获的生物量和目的蛋白表达量进行比较，结果如图5。以乳糖为诱导剂菌株生长略优于以IPTG为诱导剂;诱导剂和温度对菌株生长均有极显著影响，以乳糖为诱导剂菌株的生长优于以IPTG为诱导剂。

图4 乳糖诱导不同时间后表达情况Fig.4 Expression protein induced with lactose at different time

图5 乳糖和IPTG最佳诱导条件的比较的SDS-PAGEFig.5 Effect of different inducers(lactose or IPTG)on rPA expression

3.6 FAPA验证产物活性

DsbC-rPA融合蛋白进行诱导表达后进行超声波裂解菌体后，离心取上清总蛋白样品。将总蛋白利用离子交换进行分离纯化后获得纯度较高的DsbC-rPA重组目的蛋白，进一步经Ⅹa因子切割、纯化后得到重组的rPA目的蛋白。利用FAPA检测后发现，经乳糖和IPTG诱导所得到的重组DsbC-rPA产物的可溶性表达成分均具有显著的溶栓活性(图6)。

4 讨论

组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA作为第三代溶栓药物，在临床上治疗血栓类疾病具有药物半衰期长、溶栓作用强、副作用小、总体用量少、治疗费用低等优点，被认为是新一代安全、有效的溶栓药物［10］。

图6 纤维蛋白平板法检测重组蛋白质活性Fig.6 Thrombolytic activity assay of the recombinant proteins

由于rPA含有高达9个二硫键，因此在大肠杆菌中表达时极易形成包涵体致使重组产物生物活性丧失。为了确保目的蛋白形成正确的二硫键与空间构象，本研究将rPA编码基因克隆到DsbC信号肽及其基因下游。DsbC信号肽可将融合蛋白转运到大肠杆菌细胞周质空间，然后在DsbC的辅助作用下催化二硫键的形成。DsbC是大肠杆菌重要的二硫键合成酶之一，可以显著提高重组蛋白质二硫键的正确形成并实现其可溶性表达［11］。前人的研究已发现，将DsbC与rPA共转化入大肠杆菌表达后，可以显著提高rPA的可溶性表达比例［12］。而在本研究中，我们直接采用将DsbC与rPA融合共表达的方式，成功实现了重组蛋白的高效可溶性表达，目的蛋白在不需进行包涵体复性操作且在未切去DsbC标签的情况下，即可表现出明显的溶栓活性，从而大大简化了利用大肠杆菌这一目前最为成熟、成本最低廉的表达系统生产可溶性、活性rPA的操作工艺。

IPTG是lac操纵子最有效的诱导剂，但由于其成本极高以及对宿主菌具有一定毒性等缺点，致使在大规模生产重组蛋白中受到了很大的限制［13］。根据lac操纵子的调控机理，乳糖也可以对lac操纵子控制的基因产生诱导作用。乳糖所具备的无毒和价廉的优点，使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中，具有优于IPTG的潜在价值和优势［14］。本研究结果表明，在对数生长期中后期添加乳糖至终浓度为30 mmol/L，并在30℃时诱导5 h，对该工程菌的生长和诱导十分有利，从而为后续研究工作奠定了坚实的基础。诚然，本文所采用的实验设备和培养条件还只是实验室小试规模，接下来我们将进行在规模化生产条件下大肠杆菌诱导表达rPA的研究。

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Soluble expression of Reteplase in E.coli induced by lactose

TIAN Wen-jing1，LUO Xue-gang1，LU Li-hui1，NI Meng1，JING Xiao-lan1，ZHANG Tong-cun2，3
(1.Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，School of Bioengineering，Tianjin University of Scienceand Technology，Tianjin 300457，China;2.School of Medicine，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430065，China;3.Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，Tianjin 300457，China)

Purpose To establish the genetic E.coli for Reteplase，and to optimize the expression conditions induced by lactose.Methods The coding sequence of Reteplase(rPA)was amplified with PCR and then cloned into the pET40b vector.To achieve the high-level expression of soluble active reteplase，the induction expression conditions in E.coli strain BL21，including the concentration of inducer lactose，induction duration and temperature，were optimized.The thrombolytic activity of the recombinant K2Swas finally determined using an indirect fibrin plate assay.Results The recombinant plasmid pET40b-rPA was constructed successfully.Lactose could be a satisfying inductor and it obtained nearly the same yield，soluble form and activity with the expression inducted by IPTG.The result of fibrinolysis fibrin plate assay showed that the purified target protein exhibited significant fibrinolysis activity in vitro.Conclusion These researches might establish a significant foundation for the following production of rPA.

Reteplase;DsbC;lactose;E.coli;expression

Q78

A

1005-1678(2011)05-0341-04

2010-07-05

国家高技术研究发展计划(863计划)(NO.2008AA10Z336)

田文静，女，硕士研究生，主要从事基因工程药物的研究开发;张同存，通信作者，Email:tony@tust.edu.cn;罗学刚，通信作者，Tel:022-60602099，Email:luoxuegang@tust.edu.cn。

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