硫酸软骨素生产工艺研究进展

李 连，臧恒昌，孙春晓

(1.山东大学药学院，山东 济南 250012;2.山东福瑞达生物医药有限公司，山东 济南 250105)

硫酸软骨素生产工艺研究进展

李 连1，臧恒昌1，孙春晓2

(1.山东大学药学院，山东 济南 250012;2.山东福瑞达生物医药有限公司，山东 济南 250105)

本文综合国内外的相关文献，结合硫酸软骨素的性质、用途及市场，对硫酸软骨素近几年的生产工艺进行介绍并评价。

硫酸软骨素;生产工艺;糖胺聚糖

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一类含有聚阴离子的线性多糖，由 D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺通过β1-3键组成的双糖单位交替连接组成［1］(图1)。CS因硫酸化的位点和数目的不同分为 A、C、D、E、M、K 等［2］，其中最常见的是CSA和CSC［3］。不同来源的CS所含的CS种类、相对分子质量(Mr)也不相同［4-5］，如表1所示。CS的多样性使其富有大量生物信息，这可能会影响多种生化过程［2］，是治疗骨关节炎的候选药物［6-7］，此外CS还可以抗氧化、清除自由基［8］，治疗牛皮癣［9］，作为营养保健品及膳食补充剂［10］等，具有广阔的市场前景。但是，目前我国有些企业的CS生产条件比较差，很多不能够达到清洁化生产，产品质量稳定性差，这都制约着CS产业的长期发展［11］。因此，找到一种简单，高效，清洁的生产工艺将会对CS生产企业的技术革新产生巨大的推动作用。

图1 硫酸软骨素的结构单元

目前CS的提取方法有多种，包括酶解、盐解、碱解、超声提取及无溶剂提取法等。CS的纯化方法主要有有机溶剂沉淀法、离子交换色谱法和超滤法等。

1 酶解-有机溶剂沉淀法

酶解-有机溶剂沉淀法是常用的提取纯化方法。此方法可以满足药品或食品等不同级别的要求。Volpi［12-13］利用不同的有机溶剂进行分级沉淀来制备CS。其纯化方法是将牛软骨来源的CS粗品粉碎用木瓜蛋白酶在65℃下酶解12 h，在100℃下加热30 min。过滤，滤液用阴离子交换树脂分离除去肽、核酸和寡糖。得到的溶液用1.0～1.5倍的丙酮沉淀。存在的硫酸皮肤素用铜盐沉淀除去。CS再过阳离子交换树脂得到CS钠盐。其中作者分别用丙酮、甲醇、乙醇及丙醇作为沉淀剂对CS进行了研究。CS在丙酮水溶液中是溶解度最高的糖胺聚糖类，当丙酮的浓度达到44%时，CS开始沉淀出来，并且随着丙酮浓度的增加CS的Mr和电荷密度会降低。用甲醇沉淀加入1.8倍体积的甲醇时CS所占的比例达到91.2%，加入2倍体积的甲醇时得到的为纯CS。用乙醇做沉淀剂，当加入1倍体积的乙醇时，得到的即为纯度为100%的CS。加入0.8倍体积的丙醇时就可以得到纯的CS。可见不同的溶剂有不同的沉淀能力，且随着其疏水链的增长，溶剂的沉淀能力增大。但是工业生产因乙醇易得常用作为沉淀剂，而不采用丙醇等。

表1 不同来源硫酸软骨素中硫酸软骨素的种类

Eto［14］对酶解过程进行了改进，减少了设备的投资。将鲑鱼软骨放入40～50℃的水中浸泡1～2 h，必要时可以加入盐酸。加入25%的碱(如氢氧化钠)使其达到软骨重的0.1% ～2.0%，同时加入蛋白水解酶(如胰酶)在50～60℃下搅拌3～4 h，然后在90～95℃下加热5～10 min使酶失活。加入提取液0.3% ～2.0%的活性炭在50～60℃下搅拌1～2 h以除去脂肪，除味及脱色。过滤，加入50%或更高浓度的乙醇，所得的沉淀溶解后再用高浓度乙醇沉淀一遍，脱水得到CS。林国平等［15］在碱解的基础上加入适量的胰酶进行酶解并采用乙醇进行沉淀，使CS的纯度得以提高。徐传屯等［16］以养殖鲟鱼软骨为原料分别进行碱解、盐解、酶解并利用乙醇沉淀得到CS。利用胰酶进行酶解得到的一般是Mr很大的蛋白质，这就使其容易与CS分离，这就可以降低设备投资，不采用离子交换树脂，从而降低生产成本。同时，酶解得到的大Mr的蛋白质可以开发为保健品，以实现对软骨的充分利用及清洁化生产，提高工厂的效益。生产的CS可以用来作为药物、药品添加剂、化妆品及食品添加剂。

2 酶解-超滤法

Lignot等［17］采用酶解-超滤的方法制备CS:将鳐鱼软骨加入水中使软骨碎片的含量达到90 kg/m3，加入Lypane酶制剂2 g，在 pH 6.5、65 ℃下酶解 3 h，离心。利用 Al2O3的管状膜将离心液进行浓缩，可以达到的最大浓缩比为4。然后进行透析以脱盐，透析液沉淀得到CS。王亚等［18］采用了超滤系统进行浓缩脱盐，同时也除去了小分子的杂质。但是超滤膜存在着极化现象、膜污染等，需要进一步探索。

3 无溶剂提取法

Wang等［19］利用无溶剂的方法分离 CS，纯度可以达到95.1% ±0.65%。作者将鲨鱼软骨在80℃加热10 min，然后用粉碎机粉碎，在80℃下干燥6 h。所得的颗粒再进行物理预处理得到软骨粉末，然后过300目筛以得到更细的粉末。再将氢氧化钠(1.97 g)和二氧化硅(20 g)混合粉碎1 min得到固体碱试剂。CS的无溶剂分离是在AGO-2型高强度反应器中室温下进行的。将制成的固体碱试剂加入软骨粉末中一起研磨3 min，然后转移到3%氯化钠溶液中，调pH，离心，所得的液体进行醇沉，得到CS。此方法流程简单，所使用的溶剂较少，一定程度上减少了后处理过程，利于清洁化的生产。

4 超声提取法

田甲春等［20］以猪喉管为原料，采用超声辅助法制备CS。将软骨粉碎超声辅助碱处理139 min，进一步进行酶解、除蛋白质、脱色，最后进行乙醇沉淀。采用超声结合酶解的方法制备CS得率为23.15%，纯度为86.06%。此方法在生产的周期上有较大的缩短，但是在提高收率上仍然需要做进一步的探索。

5 酶解-有机溶剂沉淀-超滤法

Murado等［21］采用一种新的优化方法提取CS，能够使其纯度达到99%。将刺鱼软骨置于80℃水浴中加热20 min以除去肌肉组织，加热后的软骨用水冲洗干净，粉碎成约10 mm的颗粒，50℃干燥。碾压成约0.5 mm的颗粒冷藏待用。将软骨加入磷酸盐缓冲液中，每1 g软骨加入酶0.75 EU，轻微搅拌，在45℃下进行酶解。酶解液中加入1倍体积的乙醇并加入氢氧化钠使其浓度达到0.2 mol/L，在20℃下反应1 h，最后进行超滤、干燥得到CS。

在软骨鱼类的软骨中主要是以CSA和CSC为主，要得到高纯度的CS是一项耗费时间、耗费大量的试剂、而且每一步操作都没有精确的数学描述［21］。CS在低温中性环境中是很稳定的，当温度高于60℃时会降解，在酸性和碱性不同条件下CS降解的特性也不同［22］。采用上述方法可以得到高纯度的CS的同时尽可能的保持了CS的结构，是一种很好的生产工艺。

6 乙酸提取法

Nakano等［23］将牛鼻软骨粉碎成1 mm3的颗粒，加入10倍体积的pH 4.5的乙酸溶液在37℃下提取7 h，离心。得到的上清液沸腾浓缩并在90℃下恒温干燥得到CS粗品。CS粗品过DEAE-Sephacel色谱柱，将透明质酸和胶原蛋白除去，得到CS。此工艺可以把牛鼻中70%以上的CS提取出来，是一种低成本、低消耗的适合工厂生产的工艺。但是目前工厂中应用并不很广泛，主要原因可能是其生产效率不高。

7 结语

在CS生产过程中采用碱解的方法会导致其降解，而且软骨中的胶原蛋白、黏蛋白不易除去，生产周期长，极大限制工厂效益［24］。盐解法和超声法因其产率较低，经济效益不高，目前应用不广泛。国内目前应用较多的是酶解法和乙醇沉淀法，此方法的酶解效率可达较高，生产周期较短，产品纯度高，对生产过程中产生的副产物也可以最大化的利用，如生产胶原蛋白等，降低对环境的污染，是一种比较理想的提取纯化工艺。将实验室的高纯度的生产工艺转化到实际的大规模工业生产中是十分有意义的。

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Research process on production technique of chondroitin sulfate

LI Lian1，ZANG Heng-chang1，SUN Chun-xiao2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Shandong Freda Biophar Co.，Ltd.，Jinan 250101，China)

TQ464.1;Q539

A

1005-1678(2011)05-0415-03

2010-06-21

李 连，男，硕士研究生;臧恒昌，通信作者，教授，主要从事近红外光谱分析技术应用于制药工艺的优化研究，Tel:0531-88380268，E-mail:zanghcw@126.com。