应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌

胡连霞

（河北出入境检验检疫局，石家庄 050051）

应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌

胡连霞*

（河北出入境检验检疫局，石家庄 050051）

建立环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌的方法，通过肉眼可见的白色沉淀，判断检测结果。将阪崎肠杆菌（ATCC29544）的16S-23SrRNA间区序列作为靶基因，设计2对特异引物，优化反应条件，进行LAMP扩增。对产物进行酶切分析，与理论上的预期结果相一致。通过测序比对，与GenBank上报道的同源性达到99%。用25株食源性致病菌证实该引物特异性强。LAMP扩增20min，其灵敏度为4.3×102fg/tube，结果表明，LAMP方法检测阪崎肠杆菌，灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。

环介导等温扩增；LAMP；检测；阪崎肠杆菌

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii，E.sakazakii）是肠杆菌科中无芽孢而呈棒状的革兰氏阴性杆菌，为条件致病菌。阪崎肠杆菌能在很宽的温度范围内生长（6℃～47℃），比其他肠杆菌科细菌生长范围更宽，而且迟滞时间和时代更短。2004年初，联合国粮农组织和世界卫生组织在日内瓦召开的专家咨询会，指出婴儿配方粉中即使只存在微量的阪崎肠杆菌污染（＜3 CfU/100g） 也能导致感染的发生。因此，建立灵敏、特异的检测方法尤为重要。

目前，阪崎肠杆菌传统检测方法和免疫学方法费时费力、灵敏度较低。2004年，FAO/WHO召开了两次国际相关会议，建议采用国际通用的分子生物学方法检测阪崎肠杆菌，来弥补传统方法的缺陷。分子检测方法如PCR，灵敏、快速，但对操作、设备条件、工作环境均有较高的要求，仍不能进行广泛的普及和推广。

2000年，日本荣研化学株式会的Notomi T等开发的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是一种新的核酸扩增方法，其基本原理是对靶基因的6个区域设计4条特异的引物，在一种链置换DNA聚合酶作用下，恒温（65℃左右） 几十分钟，即可扩增靶DNA片段达109～1010数量级。DNA在高效延伸合成的同时，会生成相应大量焦磷酸镁的衍生物，即呈现肉眼可见的白色沉淀。只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能判断扩增与否。因此，LAMP方法因其不依赖于昂贵的PCR仪和试剂，使其更利于在基层机构的推广和应用，从而将成为取代PCR的核酸扩增新技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii）：ATCC29544、ATCC51007、ATCC51024；大肠杆菌 O157：H7（E.coli O157： H7）： ATCC43889、 IQCL10102、EDL933、CMCC44828；大肠艾希氏菌（E.coli）：CGMCC11229；沙门氏菌（salmonella）：CMCC47005、CMCC50047、CMCC50083、CMCC50104、CMCC50 001、CMCC50004；痢疾志贺氏菌（Shigella dysente riae）：CMCC51054；福氏志贺氏菌（Shigellaflexneri）：CMCC51061；鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii）：CM CC51149、CMCC51522；单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）：ATCC7644、CMCC54001；金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）：CGMCC26003；蜡样芽孢杆菌 （Bacillus cereus）：ATCC7064、CMCC63302；绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）：CMCC10104；小肠结肠炎耶尔森杆菌（Enterobacte yersinia）：CMCC52302；普通变形杆菌（Proteus vuLgaris）：CMCC49027；产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）：CICC22949、CMCC64609。

菌株来源：ATCC由美国菌种保藏中心提供；IQCL由中国检验检疫科学研究院提供；EDL和CMCC由中国医学细菌保藏管理中心提供；CGMCC和CICC由中国工业微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 试剂

BstDNA聚合酶：NewEngland Biolabs；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×Loading buffer、DNA Marker DL100、DL2000、LAMP引物合成等：上海生工生物工程有限公司；DNA试剂盒：Bio Basic Inc.；营养琼脂培养基、营养肉汤等：北京路桥公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅；SIGMA3K30高速冷冻离心机；Whatman TGradient PCR扩增仪；LRH-150B恒温培养箱；KodakEDAS290凝胶成像系统；DXY-33A型电泳仪；0.5～1000LlBIOHIT微量移液器。

1.3 方法

1.3.1 试验菌株纯培养

3株阪崎肠杆菌菌株和25株食源性致病菌菌株接种于新鲜无菌的营养肉汤培养基中，37℃培养12 h。从培养液中各取1 mL直接用试剂盒法提取各菌基因组DNA，进行Lamp和PCR试验。

1.3.2 模板DNA的制备

按照DNA试剂盒的说明进行，提取的DNA，溶解于100 μL的洗脱缓冲液中，并储存在-20℃备用。

1.3.3 模板DNA含量的确定

根据测定模板DNA稀释105倍后的OD260读数，计算DNA含量为2.15×1011fg/μL。

1.3.4 LAMP引物设计

根据Genebank中的阪崎肠杆菌基因序列，进行比对，确定阪崎肠杆菌（ATCC29544）在GenBank中（基因号为AY702093）16S-23SrRNA间区序列为保守序列。利用软件（https：//primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html）在线设计4条LAMP引物：两条外引物 F3 （5’-CGGTTGGATCACCTCCTTAC-3’） 和 B3（5’-CGGTAACGCCTTTCACTCAT-3’），两条内引物FIP （ 5’-CTTCGCTTTCGCAGACAACCCTTCGCG TGCTCACACAGAT-3’）和 BIP（5’-TTCGTCTAGA GGCCCAGGACACTTAGGGGATTCGAACC-3’），扩增基因组中的位置从125至327区域203 bp基因片段。各引物在基因组中的位置及设计的HinfⅠ酶切位点如下页图1所示。对GenBank中阪崎肠杆菌（基因号AY702093）16 s～23 s RNA间区序列设计引物，由正向序列F2和F1的一个互补序列构成FIP，由正向序列B2和B1的一个互补序列构成BIP，方块表示相应目的基因序列上的HinfⅠ酶切位点。

1.3.5 LAMP和PCR反应体系

图1 每条引物在基因组中的位置及设计的HinfⅠ酶切位点

LAMP反应体系：外引物各0.2 μmol/L、内引物各 1.6 μmol/L、2.5 μmol/L dNTP、1.6 mol/L Sigma 甜菜碱、4 μmol/LMgSO4、10×Bst DNA 聚合酶反应缓冲液，8U的Bst DNA聚合酶大片段、2 μL DNA模板，用灭菌双蒸水补足25 μL。

PCR反应体系：上下游引物各10 μmol/L、2.5 μmol/L dNTP、10×聚合酶链反应缓冲液（Mg2+Free）、25 μmol/L MgCl2、5U 的 Taq DNA聚合酶、2 μL DNA模板，用灭菌双蒸水补足25 μL。

1.3.6 LAMP和PCR反应程序

LAMP体系64℃水浴加热20 min，然后80℃水浴加热10 min后，观察有无白色沉淀，判断检测结果。同时，取LAMP产物5 μL与1 μL的lodding buffer混合均匀，1.5 g/100g琼脂糖凝胶电泳后，观察梯形条带，用以证实是否发生了LAMP反应。

PCR反应体系预变性95℃、5min，变性95℃、45 s；退火57℃、30 s；延伸72℃、30 s。35个循环。

1.3.7 LAMP产物进行酶切分析

为了确认扩增产物结构，扩增产物被HinfⅠ酶切。10U的 HinfⅠ、10×HBuffer、8 μLLAMP 产物和灭菌双蒸水补足20 μL的反应体系。于37℃恒温 24 h后，取酶切产物 5 μL，与 1 μL的 lodding buffer混合均匀，2 g/100g琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。

1.3.8 PCR产物测序结果进行比对分析

PCR引物是检测阪崎肠杆菌的LAMP方法的两条外引物，PCR扩增产物经上海生工生物技术有限公司测序，测定的序列在GenBank上与文献报道的靶基因序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 LAMP产物的可视结果

LAMP反应扩增大量核酸的同时，产生大量的副产物——肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，如图2所示，通过肉眼观察白色沉淀，判断检测结果。管1，阳性结果，由于DNA的大量扩增，在阳性的反应混合物中产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀；管2，阴性对照，用灭菌的双蒸水代替DNA模板参加LAMP反应。

图2LAMP的可视结果

2.2 LAMP扩增产物酶切分析结果

预期的扩增产物结构如图3所示。第一和第四行中显示HinfⅠ限制性酶切位点和酶切片段的大小；第二和第三排显示B+、B-、F+和F-结构的DNA大小；+是目标序列B1和F1c之间的距离；-是+的互补序列。由图1和图3计算可知，LAMP引物设计的HinfⅠ酶切位点主要产生200 bp-、178 bp-、156 bp-片段和少量29 bp-、32 bp-片段。LAMP扩增产物经限制性内切酶HinfⅠ消化，电泳结果如图4所示，与理论上的预期值相符。泳道1：LAMP扩增阪崎肠杆菌阳性产物；泳道2：阴性对照；泳道3：HinfⅠ酶切阳性产物结果（片段200 bp-，178 bp- 和 156 bp-）；泳道 M：100 bp laddermarker。

图3 预期的扩增产物的结构示意图

图4 LAMP扩增产物酶切分析

2.3 PCR扩增产物测序比对结果

采用外引物进行PCR扩增得到203 bp左右目的片段，经上海生工生物技术有限公司测序，测定的序列在GenBank上与报道的靶基因序列比对，比对结果见图5所示，Query表示提交的序列，Sbjct表示blast到的AY70 2093序列。与AY702093基因序列同源性达到99%。该片段能作为特异性基因序列来设计引物，以建立阪崎肠杆菌种特异性分子检测技术。

2.4 LAMP引物的特异性

对3株阪崎肠杆菌菌株（ATCC29544、ATCC 51007、ATCC51024） 和25株其他肠道致病菌特异性检测结果如表1所示。LAMP检测所有阪崎肠杆菌菌株都能产生特异扩增的梯形条带，有白色沉淀，呈阳性结果；其余25株其他肠道致病菌均未产生特异扩增的梯形条带，无白色沉淀，呈阴性结果。

图5 PCR产物测定的序列与GenBank中目的基因序列的比对结果

2.5 LAMP检测方法的灵敏性

用洗脱缓冲液进行100～1011系列稀释基因组DNA，经紫外分光光度计测定，得到DNA含量为 2.15×1011fg/μL，依次取倍比稀释 DNA2 μL作为模板进行LAMP反应，扩增20 min，灵敏度达 4.3×102fg/tube。

3 讨 论

近年来，阪崎肠杆菌的检测方法取得重要进展，针对保守序列如16SrRNA、23S rRNA和16S-23SrRNA间区序列（ITS） 等的分子检测技术也相继建立。LAMP方法作为一种新的恒温核酸扩增方法，由4条引物识别靶基因的6个特定区域，从而增强了方法的稳定性和可重复性，和其他核酸扩增技术相比，不需要模板的热变性、长时间温度循环、昂贵的精密仪器，尤其是反应结果直接通过肉眼观察是否产生白色沉淀（混浊）来判断，可以省去繁琐的电泳、紫外观察、凝胶成像等过程，从而大大缩短了检测时间，节约了人力和物力。本研究从阪崎肠杆菌16S-23SrRNA间区序列上找到一段相对保守序列，建立的阪崎肠杆菌的LAMP检测方法，切实可行，具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的优点，有关纯培养的阳性菌株与阳性样品之间是否存在差异，需要大量累积检测数据，有待于我们下一步的深入研究。今后将LAMP应用于实际样品食源性致病菌的快速检测具有广阔的应用前景。

表1 LAMP引物的特异性

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Application of loop-mediated isothermal amplification detection of nterobacter sakazakii

HULian-Xia*
（Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang 050051，China）

Establish a loop-mediated isothermal amplification method for detection of the Enterobacter sakazakii，through white precipitates viewed with the naked eye to determine test results.The sequences of 16S-23Sr RNA of Enterobacter sakazakii（ATCC29544） was as target gene，2 pairs ofspecifical primers were designed.Byoptimization of reaction conditions，the sequences were amplificated by LAMP.Detection of Enterobacter sakazakii strains by LAMP was positive.The positive products were digested with restriction enzyme，which the theoretical expected results are consistent with.the result of sequencing of PCR with the outer primers of LAMP was compared with gene sequences in GenBank and reached the reported 99%homology.Specificity of the LAMP primers was confirmed using 25 strains of food borne pathogens.The sensitivity of the LAMP was 4.3×102fg for 20 min.The results showed that，LAMP method for detection ofEnterobacter sakazakii was high sensitivityand specificity，shorter time-consumingand simple.

loop-mediated isothermal amplification；LAMP；detection；enterobacter sakazakii

TS252.2

A

1673-6004（2011）02-0036-04

* 胡连霞，女，1972年出生，2009年毕业于河北农业大学科技学院微生物专业，工程师。

2011-04-17