固定化木瓜蛋白酶的研究进展

刘嘉俊 李汴生

（1华南理工大学轻工与食品学院，广州 510641） （2广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广州 510300）

固定化木瓜蛋白酶的研究进展

刘嘉俊1，2*李汴生1

（1华南理工大学轻工与食品学院，广州 510641） （2广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广州 510300）

木瓜蛋白酶具有水解蛋白质能力强的特点，但游离的木瓜蛋白酶稳定性差，难以回收利用；固定化木瓜蛋白酶既保持了酶的催化性质，又克服了游离酶的不足，具有广泛的发展前景。

木瓜蛋白酶；固定化；应用

1 木瓜蛋白酶及其固定化应用

木瓜蛋白酶别名为木瓜酶，纯木瓜蛋白酶是有由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23 406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶，为乳白色至微黄色粉末，具有木瓜特有的气味，稍具有吸湿性。水解蛋白质能力强，但几乎不能分解蛋白胨。最适作用温度65℃，最适作用pH为5.0，易溶于水、甘油，不溶于一般的有机溶剂，等电点为pH8.75。

虽然木瓜蛋白酶具有催化能力强，作用底物专一，反应条件温和等优点，但稳定性差，在温度、pH和无机离子等外界因素影响下，容易变性失活，而且木瓜蛋白酶一般都是在水溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有较高活力，也难以回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅成本较高，而且难以连续化生产。因此，近年来一直在研究固定化木瓜蛋白酶技术，人们试图用固定化的方法使木瓜蛋白酶固定在载体上，并在一定空间范围内进行催化反应。固定化酶既保持了酶的催化活性，又克服了游离酶的不足，具有增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。

2 木瓜蛋白酶固定化的基本原理

酶的固定化方法有吸附法、包埋法、交联法等，这些方法各有利弊。载体材料作为固定化酶的重要部分，其结构和性能对固定化酶的酶学性质有很大的影响，因此很多学者一直致力于对载体的研究，以求获得适合于某种酶的价格低廉的载体，以及操作简便和酶活力回收更高的固定化方法。

3 木瓜蛋白酶的固定化技术

3.1 吸附法

近年的研究中关于木瓜蛋白酶的固定化技术使用较多的是吸附法，吸附法主要有物理吸附法和离子交换吸附法两种。物理吸附法是以比表面积较大的物质为载体（无机载体如活性氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、高岭土、多孔玻璃、硅胶，二氧化钛等；有机载体如面筋、淀粉、纤维素、胶原、塞璐璐和火棉胶等），其特点是吸附作用选择性不强，吸附不牢，还会引起吸附变性。离子交换吸附法是以DEAE-纤维素、CM-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等为载体。2005年，高波等首次利用冷冻-真空吸附法在介孔材料SBA-15中固定了木瓜蛋白酶，与普通的浸渍方法相比，此法不仅可以制备高祖装量的固定化酶，每克载体固定量可达450 mg，同时酶的活性仍然保持，并得到较好的固定化酶性质（如高稳定性），在90℃保温30 min仍可保留70%的活力。2005年，沈斌等提出酶的“柔性固定化”模型，并以Mannich反应得到单载量为0.4 mmol NH2/g～6.0 mmol NH2/g的胺化苯聚乙酰树脂为载体，以双醛淀粉为柔性链，对木瓜蛋白酶进行柔性固定化，酶活回收率可达40%～50%，相当于手臂固定化酶活力率的1.8～2.4倍，且柔性固定化酶稳定性较好，该结果说明，酶的“柔性固定化”模型可以改善传统共价结合固定化及手臂固定化酶活力回收率不高的缺陷。2007年，王安明等通过超声条件下硅酸四乙酯与γ-氨丙基三乙氧基硅烷的同步水解，一步制备了带氨基的二氧化硅微球，并在其表面沉积了银纳米粒子，以此负载银的二氧化硅微球作为载体固定木瓜蛋白酶，研究了银纳米粒子负载量对木瓜酶固定化的影响，考察了固定化木瓜蛋白酶的性能，结果表明，当载体的银负载量为0.68 g/100g时，固定木瓜蛋白酶活回收率达到最高，比使用未负载银的载体提高了188%。该固定酶比游离酶具有更好的热稳定性，在重复使用20次后仍保持原有酶活的43%，4℃下储存2个月后酶活基本没有下降。

3.2 包埋法

包埋法是用物理或化学的方法把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产。2001年，李红等研究了以壳聚糖微球为载体固定化木瓜蛋白酶的特性，包括其形态、外观和酶学性质，结果表明：壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶是粒径分布范围较均匀的球形微粒，固定化酶的表观米氏常数Kmapp（酪蛋白） 为0.055%，是溶液酶米氏常数Km的0.13倍，最适pH为8.0，pH稳定性在7.0左右，热稳定性在15℃～35℃范围内，操作半衰期为25 d，该结果为壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶酶反应器的试制和研究提供了重要的参考。2005年，刘琳琳等以磁性金属鳌合琼脂糖微球为载体，利用金属鳌合配体（IDA-Cu2+）与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理，定向固定了木瓜蛋白酶。固定化最适条件为Cu2+1.5×10-2mol/g载体、固定化时间为4 h、固定化pH7.0、给酶量30 mg/g载体。固定化酶的最适反应温度70℃、最适反应pH8.0，固定化酶的热稳定性明显高于溶液酶，固定化酶活力回收为68.4%，具有较好的操作稳定性，载体重复使用5次后固定化酶酶活力为首次固定化酶的79.71%。2008年，何平等以乙腈作为有机介质，在微水有机溶剂体系中以Boc-Trp-OH和Phe-NH2为底物，用海藻酸钠、壳聚糖固定化木瓜蛋白酶催化合成Trp-Phe-NH2时，产率为27.8%，在这一合成反应中，对pH值、离子强度、溶液含量、反应温度、酶用量和反应时间进行正交试验，证明pH是本合成过程的最重要影响因素。反应体系以乙腈为有机介质，在微水有机溶剂体系中以Boc-Tyr-Pro-OMe和Trp－Phe-NH2为底物，用IPSAC催化合成Tyr-Pro－Trp-Phe-NH2，产率为35.2%。2008年，王红玉等以糖和脂质体作为溶胶-凝胶法固定木瓜蛋白酶（Papain） 过程中的保护剂，研究了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、麦芽糖及构成脂质体的正癸烷溶液中胆固醇含量、卵磷脂与胆固醇质量比等因素对固定化酶活性的影响。结果表明，80 μL20 mg/mLPapain溶液与15 mg木糖、500 μL正癸烷溶液（溶有体积分数1.5%的胆固醇，卵磷脂与胆固醇质量比为4.5∶1）充分混合后制备的固定化酶活性最高，在优化条件下制备的固定化酶包封率为42.0%，活力回收率为61.2%；SEM分析表明，固定化酶形态呈球状且大小均匀，内孔分布呈蜂窝状；破膜剂对固定化酶活性发挥的影响研究表明，TritonX-100的效果最好。固定化酶包埋法是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有着诱人的应用前景。

3.3 交联法的应用

交联法是依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。2004年，黄宜兵等以变性的卵清蛋白为载体，用戊二醛为交联剂固定木瓜蛋白酶，通过正交试验考察了固定化pH值、交联剂戊二醛浓度、交联时间和酶用量对固定化木瓜蛋白酶活力的影响，确定了最适固定化条件：戊二醛体积分数为5%，pH 6.0、交联时间20 h，每克载体含酶量12 mg。对比研究了游离木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶的性质，所得到的固定化木瓜蛋白酶最适温度90℃，最适pH 9.0，米氏常数53.6 mg/mL，其热稳定性及耐热性均较游离酶显著提高。2001年，王海英等从8种载体材料中选取自制的氨基含量约2.878 mmol/g的甲壳质作为固定化载体，采用吸附交联法，以戊二醛为交联剂，对木瓜蛋白酶进行固定化。17.5 mg/g的固定化酶/载体比例、pH6、5℃条件下，先吸附10 min，再以体积分数0.7%的戊二醛交联12 h，所得固定化酶酶活回收可达52.0%，酶活力为3.54 U/g。固定化酶在65℃以下稳定，溶液酶在55℃以下稳定；固定化酶在pH 7.0以下稳定，溶液酶在pH 6.0以下稳定。5℃条件下，固定化酶贮藏半衰期为183 d，以酪蛋白为底物，固定化酶的操作半衰期可达27 d。用固定化酶水解甲壳胺，产物分子量小于100 000的甲壳胺低聚糖得率约为45.55%。2005年，肖宁等以介孔分子筛MCM-41作为载体，戊二醛作为交联剂，对木瓜蛋白酶进行了固定化，研究了固定化条件对酶活性及酶活性回收率的影响，并对固定化酶的连续操作稳定性做了初步探讨。结果表明：当1 g载体的给酶量为20 mg、固定化温度10℃～20℃、固定化时间2 h、pH 7.0、戊二醛体积分数0.75%时，木瓜蛋白酶的固定化效果最好，此时酶活性平均回收率达55%左右，固定化酶具有良好的连续操作稳定性，半衰期可达26 d。2007年，黄泽元采用壳聚糖与羧甲基纤维素钠形成胶囊将木瓜蛋白酶固定化，研究了固定化木瓜蛋白酶的固定化条件。结果表明：在给酶量为50 mg/100mL、壳聚糖质量分数为0.2%、pH7.5、固定化温度50℃条件下，所得固定化木瓜蛋白酶活力回收率可达69.8%。

4 结论

综上所述，固定化酶既保持了酶的催化性质，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点。

a.酶的稳定性增加，减少温度、pH、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。

b.固定化酶可反复利用或连续使用较长的时间，提高酶的利用价值，降低生产成本

c.固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。

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Research progresses on immobilization of papain

LIUJia-jun1，2*LI Bian-sheng1
1（College of Light Industryand Food Engineering，South China Universityof Technology，Guangzhou 510641，China）
2（Department ofFood and Bioengineering，GuangdongIndustryTechnical College，Guangzhou 510300，China）

Papain has a strongabilityofhydrolyzingproteins，but a poor stability，and is difficult torecycle.This paper discussed the immobilization technology of papain in recent years.A fixed papain，with a broad development prospects，not only maintain the enzyme's catalytic properties， but also overcome the shortcomings of the free enzyme.

papain； immobilization；application

TS261.1

A

1673-6004（2011）02-0008-03

*刘嘉俊，男，1982年出生，华南理工大学在职硕士研究生，食品工程专业，讲师。

2011-04-06