葡萄籽中胰脂肪酶抑制物提取工艺

田强，吴子健，黄道荣，王吰，张静，付何蕾

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

葡萄籽中胰脂肪酶抑制物提取工艺

田强，吴子健*，黄道荣，王吰，张静，付何蕾

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

以胰脂肪酶抑制率为响应值，采用L25（56）正交设计和Box-Behnken试验法相结合的手段，研究自葡萄籽中提取可抑制胰脂肪酶活性产物的最佳工艺条件。研究结果表明：当料液比为1∶8（g/mL）、乙醇浓度54%、浸提温度67.6℃、浸提时间1.3 h时，葡萄籽提取物对胰脂肪酶的抑制率达61.53%以上。

葡萄籽浸提物；胰脂肪酶抑制物；最佳的浸提条件

针对人体消化系统中参与脂类代谢过程的酶类，特别是胰脂肪酶，选择性筛选减肥保健食品、控制和减少脂肪吸收已经成为治疗肥胖的有效方法。大量来自天然植物的小分子物质，如皂甙类物质、多酚类物质、萜类物质等[1]都成为科研人员筛选可抑制胰脂肪酶活性或可进一步成为天然减肥药物的重要来源。其中，近年来国内外研究表明来自葡萄籽的天然提取物可有效抑制胰脂肪酶活性，2003年，美国新泽西州立大学的Diego A.Moreno等[2]研究表明其可有效抑制脂肪酶的活性。2009年任秀娟等[3]，以及本课题组[4]分别研究和报道了从葡萄籽中提取有效物质可作为胰脂肪酶抑制物，并且从酶动力学的角度对胰脂肪酶活性的抑制率以及酶抑制类型做了较为深入的研究，研究结果表明：来自葡萄籽的抑制物对于胰脂肪酶活性的抑制作用属于非竞争性抑制。

本文主要以提取物对胰脂肪酶抑制率作为衡量效应因子，利用minitab软件，以正交试验设计与Box-Behnken法相结合研究自葡萄籽中提取可抑制胰脂肪酶活性产物的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料及试剂

葡萄籽：取自天津王朝葡萄酒厂；三丁酸甘油酯：Sigma公司；胰脂肪酶：Sigma公司；酚红－麝香草酚蓝混合指示液；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器

FW80型微型高速万能粉碎机：天津市华鑫仪器厂；HSS1-B型恒温水浴槽：成都仪器厂；RE52-98型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FA2004N型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；pH3-2B型pH计：上海雷磁电子仪器有限公司；WFJ7200型分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；FDU-810型冷冻干燥机：EYELA日本东京理化；Sigma 3-18K型低温高速离心机：INNOVA公司超低温冰箱；等。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽浸提物的制备流程

葡萄籽→干燥→粉碎→过筛（30目）→正己烷脱脂2次（料液比1∶2.5，30 min/次）→备用的原料→乙醇浸提（3次）并离心，合并上清液→旋蒸浓缩（45℃）→真空冷冻干燥→胰脂肪酶抑制物→测定多酚含量及其对胰脂肪酶活力的抑制性

1.2.2 总多酚含量测定[5]

总多酚含量的测定按照Folin-Ciocalteu法。

1.2.3 胰脂肪酶活力的测定[4]

脂肪酶活力单位定义为：37℃，pH为7.5条件下，脂肪酶每分钟水解三丁酸甘油脂生成1 μmol脂肪酸所需的酶量，为1个活力单位。

1.2.4 葡萄籽浸提物对胰脂肪酶抑制活性的测定[4]

1.2.5 正交试验法确定影响葡萄籽中胰脂肪酶抑制物浸提率的主要因素

为有效地从葡萄籽中提取对胰脂肪酶的活性具有抑制作用的有效成分，试验中以葡萄籽浸提物对胰脂肪酶的抑制率为提取条件的响应，并采用L25（56）正交设计作为过程优化的初步试验考察对抑制物的提取具有影响的因素：乙醇浓度、料液比、浸提温度和浸提时间，以确定各因素对响应值影响的重要性和最大响应区域。

1.2.6 Box-Behnken试验法确定葡萄籽中胰脂肪酶抑制物的最佳提取条件

根据正交试验结果，针对胰脂肪酶抑制物提取影响较大的因素，采用Box-Behnken设计进一步优化提取最佳条件。

2 结果与分析

2.1 正交试验法确定影响葡萄籽中脂肪酶抑制物提取率的主要因素

正交试验方案如表1所示，结果及分析见表2，表3。

表1 葡萄籽胰脂肪酶抑制剂提取条件筛选的正交试验因素与水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

由表3的结果可知，在试验范围内，在影响酶抑制效果的诸提取因素中，料液比不显著，而乙醇浓度、浸提温度和浸提时间均对酶抑制效果有显著影响，各显著因素影响次序为：浸提温度>乙醇浓度>浸提时间，提取的最佳条件为A3B2C4D5附近。

表2 葡多酚提取条件筛选试验方案、试验结果及分析计算表Table2 Design and result of orthogonal experiment

表3 葡萄籽中胰脂肪酶抑制物提取条件筛选试验结果方差分析Table3 Variance analysis

2.2 Box-Behnken试验进一步优化提取条件

利用正交试验设计能够确定各因素对提取率影响的重要性，并找到有利于葡萄籽中胰脂肪酶抑制物提取的最大响应区域，但它不能在给出因素和响应值之间的一个明确函数表达式，即回归方程，从而无法找出影响因素的最佳组合和响应面值的最优值。于是采用Box-Behnken试验法进一步考察了它们对葡多酚提取及其对脂肪酶的抑制率的影响，利用minitab软件设计了试验，对试验结果进行了分析。并对提取条件进行优化。

根据正交试验的结果，在选定料液比为1∶8的前提下，选择 3个因素：乙醇浓度（X1）、浸提温度（X2）、浸提时间（X3）为自变量，以提取物对脂肪酶的抑制率为响应值，利用minitab软件设计了Box-Behnken试验（如表4所示），并对试验结果进行了回归分析以及相应的方差分析（如表5和表6所示）。

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table4 The Box-Behnken experiment design and response values

表5 Box-Behnken试验结果的回归分析Table5 Result of regression analysis of the Box-Behnken design for inhibition rate

表6 酶活抑制率回归模型方差分析Table6 Variance analysis of regression model for inhibition percentage

采用minitab软件对表4中的葡萄籽浸提物对胰脂肪酶的抑制率数据进行回归分析，得到各影响因子的偏回归系数及其显著性（表6）。

从表5、6可以看出，3个因素在一定范围内对脂肪酶的抑制效果的影响均非常显著，且交互作用也很显著，F值为62.23，多元相关系数为R-Sq=99.12%，说明该模型对实际情况拟合较好，模型高度显著，可用来进行响应值预测。

运用Minitab软件的响应优化器（Response Optimizer）计算出各提取条件的最优解并绘图，如图1所示。

由图1可直观得出最优提取工艺为乙醇浓度54%、浸提温度67.6℃、浸提时间1.3 h时，提取产物对脂肪酶活抑制率达61.53%。

2.3 验证试验

按照优化后的提取条件：乙醇浓度54%、浸提温度67.6℃、浸提时间1.3 h、料液比为1∶8，进行了脂肪酶抑制剂提取的验证实验，实测酶抑制率达到62.02%，与预测值61.53%较接近，预测精度达96.56%，表明了正交试验和Box-Behnken方法联用的可行性，也证明了该套统计学试验设计与分析方法在生物加工过程应用中的准确性和可靠性。

3 结论

葡萄籽中提取的多酚类成分对脂肪酶有明显的抑制作用。以抑制率为响应得出最佳提取条件为料液比为1∶8、乙醇浓度54%、浸提温度67.6℃、浸提时间1.3 h，在该条件下的提取物对脂肪酶抑制率达61.53%以上，该参数为自葡萄籽制备脂肪酶抑制剂的中试生产提供了参考。

[1]Rahul B Birari,Kamlesh K Bhutani.Pancreatic lipase inhibitors from natural sources:unexplored potential[J].Drug Discovery Today,2007,12(19/20):879-889

[2]Moreno D A,Ilic N,Diego A.Alexander Poulev，et al.Inhibitory effectsofgrapeseedextractonlipases[J].Nutrition，2003,19(10):876-879

[3]任秀娟,马海乐.葡萄籽提取物脂肪酶抑制活性筛选及抑制机理的研究[J].食品工业科技,2009,30(6):181-186

[4]吴子健,王吰,郑俊清,等.葡萄籽浸提物对胰脂肪酶活性抑制的研究[J].食品研究与开发，2009,30(9):83-86

[5]王宏.苹果渣中多酚物质的提取、分离、及其抗氧化活性的研究[D].陕西师范大学硕士学位论文，2006:26-28

Optimizing Conditions for the Isolation of Pancreatic Lipase Inhibitive Substance from Grape Seeds

TIAN Qiang,WU Zi-jian*,HUANG Dao-rong,WANG Hong,ZHANG Jing,FU He-lei
（School of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology,Tianjin 300134,China）

In order to optimize the extraction condition of pancreatic lipase inhibitive substance for grape seed（GS）,the combination of orthogonal design（L25（56））and Box-Behnken design is performed,taking pancreatic lipase inhibition rate as response value.The results show that,when ratio of CGS powder to extractant（ethanol）is 1 to 8,the concentration of ethanol is 54%,the extraction temperature is 67.6℃,and extraction time is 1.3 h,the optimal inhibitive rate of CGS extract to pancreatic lipase（61.53%）is realized.

grape seed extracts;pancreatic lipase inhibitors;optimal extraction condition

天津商业大学青年科研培育基金项目（080109）

田强（1956—），男（汉），讲师，学士，研究方向：工业微生物育种及活性产物提取。

*通讯作者

2009-11-02