阿柔比星建立肾病模型的评价

吴汉利 孙 伟

1 南京中医药大学（南京 210046）

2 江苏省中医院（南京 210029）

微小病变型肾病(MCN）是肾病综合征(NS）中常见的病理类型之一,临床表现为原发性NS。MCN约占儿童NS中的80% ～90%、成人NS中的20% ～30%[1]。因此,研究急性肾病模型在儿童肾病研究中显得尤为重要。目前应用的ADR微小病变性肾病模型的制作由Tullio Bertani等[2]于1982年创立，鲁斌等[3]将此法进行改进，造模后约1个月出现典型NS表现。但此法死亡率很高,动物常死于ADR毒副作用引起的严重腹泻及心脏毒性，目前国外已很少应用此模型。为此，本试验采用毒性低的阿柔比星分次尾静脉注射的方法建立肾病模型并从血生化、病理变化方面对阿柔比星肾病模型进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级纯系SD大鼠30只,雌性,体重(200±20）g,购自军事医学科学院实验动物中心 (许可证编号：SCXK京2007－004），适应性喂养1周,测尿蛋白阴性后进入实验。实验期间,所有大鼠自由饮水,进食普通饲料。

1.2 实验药物 多柔比星,规格10mg/支(深圳万乐药业有限公司生产）；阿柔比星,规格20mg/支(深圳万乐药业有限公司生产）。

1.3 模型建立与分组 造模方法采用分次注射法。30只大鼠随机分为正常组、阿柔比星组、多柔比星组。模型组每只鼠分2次经尾静脉注射相应药物；第1次注射4mg/kg，间隔1周，再注射3mg/kg。正常组以同样方法注射相应量的生理盐水。从第1次给药起,于第1、2、3、4周末留取24h尿,其间给予高蛋白饮食。第4周末处死大鼠，取材。

1.4 实验方法 尿蛋白定量测定采用免疫比浊法；血浆白蛋白测定采用溴甲酚绿法；总蛋白测定采用双缩脲法；血清胆固醇测定采用胆固醇氧化酶法；血肌肝测定采用苦味酸速率法。肾病模型的病理变化在光镜、电镜下进行观察。光镜由山东省潍坊市益都中心医院病理室完成，常规行HE、PAS染色观察。组织切片的电镜观察由南京军区总医院电镜室完成。肾皮质组织经3%戊二醛、1%锇酸双固定,磷酸缓冲液漂洗,丙酮系列脱水,E-pon812树脂包埋,LKBV型切片机超薄切片,醋酸双氧铀及柠檬酸铅双染色,最后使用JEOL Jem－1011型电镜进行观察。

1.5 统计学处理 应用SPSS 11.5统计软件。计量资料以(）表示,采用方差分析和!2检验。

2 结果

2.1 各组一般情况比较 见表1。实验第1周,多柔比星组大鼠食量下降,部分大鼠出现不同程度的腹泻。第3周出现轻度腹水。第4周水肿加重，体重逐渐下降；阿柔比星组出现类似情况，但症状轻，体重无明显变化。实验结束多柔比星组大鼠死亡4只，阿柔比星组无死亡。阿柔比星大鼠生存数与多柔比星组相比，组间差异具有统计学意义(P＜0.05）。

表1 各组死亡率比较（n）

2.2 各组24h尿蛋白定量分析结果比较 见表2。阿柔比星组与多柔比星组从第2周起尿蛋白逐渐升高,明显高于正常组(P＜0.05或0.01）。阿柔比星组与多柔比星组同时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05）。

表2 各组24h尿蛋白尿定量分析结果比较（mg/24h,）

表2 各组24h尿蛋白尿定量分析结果比较（mg/24h,）

时间0d 7d 14d 21d 28d正常组4.11±0.70 4.51±1.57 4.29±1.87 4.51±1.52 4.47±0.89阿柔比星组3.90±0.85 5.81±1.08*17.53±5.97*43.88±9.44**80.15±6.87**多柔比星组3.15±0.89 3.69±0.76 24.23±10.67**43.11±16.74**108.88±35.54**

2.3 各组24h血清生化定量分析结果比较 见表3。与正常组相比,阿柔比星组与多柔比星组血清胆固醇显著升高，而白蛋白显著降低(P＜0.01）。阿柔比星组与多柔比星组血清胆固醇、白蛋白同时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05）；3组血肌酐、尿素氮指标差异均无统计学意义(P＞0.05）。

表3 各组24h血清生化定量分析结果比较（）

表3 各组24h血清生化定量分析结果比较（）

项 目白蛋白（mg/24h）胆固醇（mmol/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）正常组25.88±1.46 1.58±0.30 7.72±0.81 38.14±5.00阿柔比星组13.51±0.94**4.51±0.51**7.74±1.17 37.36±2.54多柔比星组14.00±2.50**4.46±1.18**7.55±0.36 35.73±2.50

2.4 光镜变化 如图1。第28日光镜PAS染色情况，与正常组相比,阿柔比星组与多柔比星组肾脏病理检查无明显变化。

图1 PAS染色情况

2.5 电镜检查 如图2。与正常组相比，阿柔比星及多柔比星组肾小球上皮细胞足突广泛融合，基底膜增厚。

3 讨论

图2 电镜情况

ADR肾病模型是类似人类微小病变型肾病的动物模型。有关研究已证实,其造模机理是含醌的多柔比星在肾脏内被代谢还原为半醌型自由基,后者与氧反应产生活性氧,诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应,改变肾小球上皮细胞糖蛋白代谢,破坏肾小球滤过膜的结构和功能,最终导致膜滤过屏障的选择性变化而引起蛋白尿[4]。但此法造模大鼠死亡率高,常死于ADR毒副作用引起的严重腹泻及心脏毒性。此外造模的不均一性也严重影响了ADR肾病模型的应用。目前国外已很少应用此模型。

本实验的目的在于建立稳定可靠的急性肾病模型。我们选用同样具有肾脏毒性的阿柔比星造模，评价其肾病模型的特点。阿柔比星为新型蒽环类抗生素类抗肿瘤药，能抑制生物大分子合成,特别对RNA合成的抑制作用很强。

我们采用模型组分两次经尾静脉注射药物的方法进行造模。正常组则以同样方法注射等量的生理盐水。本研究制作的阿柔比星模型大鼠第1次给药后尿蛋白于第7日开始上升，于实验第28日达80mg/24h，与正常组相比有明显差异，同时伴有明显低蛋白血症、高胆固醇血症。与多柔比星组相比，差异无统计学意义。病理光镜显示各组均无明显变化。多柔比星和阿柔比星组电镜均出现足突广泛融合，符合微小病变型肾小球肾病病理变化，正常组则无明显改变。由此可以看出，阿柔比星模型血生化、尿蛋白变化及病理改变与多柔比星模型相似。由于阿柔比星模型组大鼠腹泻情况轻，大鼠未出现死亡，造模成功率，与多柔比星组相比，差异有统计学意义，说明阿柔比星模型造模成功率高。此外，阿柔比星组大鼠尿蛋白均一性高，说明该模型建造成立后稳定可靠。

总之，血生化、尿蛋白、病理变化均证明阿柔比星模型符合微小病变型肾病模型，同时该模型大鼠死亡率低，尿蛋白均一，值得进一步推广。但本模型尿蛋白量偏低，是否可以通过增加阿柔比星用量以提高尿蛋白量，值得进一步研究。

[1]杨霁云.微小病变型肾病[J].中华肾脏病杂志,1986，2（2）：150.

[2]Bertani T,Poggi A,Pozzoni R,et al.Adriamycin－induced nephrotic syndrome in rats[J].Laboratory Investigation,1982,46：16.

[3]鲁斌，李新民，马融.对改造的阿霉素肾病模型的评价[J].实验动物科学与管理,1999，16（3）：5 ～9.

[4]姜新猷,胡明昌.柔红霉素肾病：活性氧诱发脂质过氧化反应引起的肾组织损伤[J].中华肾脏病杂志,1991,7（7）：74.