藁本内酯抑制脂质过氧化作用的研究

龙 锐,杜俊蓉,王 蓓

1重庆医科大学附属第一医院药剂科,重庆 400016;2四川大学华西药学院药理学与生物制药系,成都 610041

藁本内酯抑制脂质过氧化作用的研究

龙 锐1,2,杜俊蓉2＊,王 蓓2

1重庆医科大学附属第一医院药剂科,重庆 400016;2四川大学华西药学院药理学与生物制药系,成都 610041

本文用维生素 E为阳性对照,探讨了藁本内酯对不同体系脂质过氧化的抑制作用。结果显示:5、20和80 mmol/L的藁本内酯对亚油酸的自发氧化,VitC/Fe2+和 NADPH诱导的线粒体氧化,组织匀浆的自发氧化和H2O2诱导氧化,均表现出较强的抑制作用(与空白对照组相比,P<0.05),其浓度与抗氧化活性呈一定的量效关系。藁本内酯的体外抗脂质过氧化作用为进一步探讨其药理作用提供了实验与理论依据。

藁本内酯;抗脂质过氧化;维生素 E;亚油酸;线粒体

当归 (Angelica sinensis(Oliv.)Diels)为伞形科当归属植物,具有补血活血、润燥滑肠、调经止痛之功效。现代研究表明,当归的主要成分为藁本内酯(Ligustilide,L IG)类及其异构物、香豆素类、黄酮类以及有机酸类[1]。藁本内酯的药理报道较多,但大部分是用当归油等含藁本内酯的混合物来完成的,因而其药理研究均不深入和细致。为此,我们从当归挥发油中提取出藁本内酯(含量大于 98%),以维生素 E(Vitamin E,Vit E)为阳性对照,分别在纯化学体系和生物体系的基础上研究藁本内酯的抗氧化作用及其剂量反应关系,为进一步探讨其药理作用提供实验与理论依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

藁本内酯由本实验室从当归中提取和纯化。其化学分析结果表明:藁本内酯含量 >98%,以二甲亚砜配成不同浓度的溶液。Vit E标准品购于上海为维他生物科技公司,还原型辅酶Ⅱ(NADPH)为 Sigma产品,其他试剂为国产分析纯。

1.2 动物

SD雄性大鼠,200～250 g,由四川大学华西实验动物中心提供。

1.3 统计学软件

实验数据采用 SPSS 13.0进行分析处理。结果表示为 ±s,应用 t检验进行组间的两两比较。

2 方法与结果

2.1 对亚油酸脂质过氧化的抑制作用

将 3 mL亚油酸加入 3 mL吐温-20中,漩涡振荡混匀后加入到 200 mL的磷酸缓冲液中 (pH 7.0)制成亚油酸乳液。将 1 mL各浓度剃度的L IG或Vit E溶液加入 10 mL的乳液中,再用磷酸缓冲液定容至 25 mL。混合溶液在 37℃处恒温,分别于 24,48, 72,96,120 h取出 100μL的乳液按硫氰酸盐方法来测定脂质氧化的程度。每 100μL乳液中加入 5 mL的 75%乙醇,0.1 mL硫氰酸铵 (30%,w/v)和 0.1 mL的氯化亚铁。用 75%乙醇做空白,在 500nm检测其吸光度。抑制率按下式计算:亚油酸抑制率 = (1-Ai/A0)×100%。式中 A0为空白对照组亚油酸乳液的吸光度,Ai为各浓度梯度 L IG或 Vit E乳液的吸光度。如图 1所示:随着时间的延长乳液在500 nm的吸光度值逐渐增大,其中空白对照组的增加趋势更明显,说明亚油酸自动氧化作用十分显著。添加抗氧化剂几个组的吸光值虽然也有上升趋势,但上升趋势相对较缓,说明亚油酸的氧化作用受到了抑制。各时间点L IG对亚油酸自发氧化都有一定的抑制作用,且呈剂量依赖性。孵育 96 h后 5,20和 80 mmol/L的 L IG对亚油酸的抑制率分别为27.1%,55.0%和 68.6%,同时阳性对照 20 mmol/L Vit E的抑制率为 41.4%。

图 1 L IG对亚油酸自发氧化的抑制(n=3)Fig.1 Inhibition effectofL IG on linoleic acid oxidation (n=3)

2.2 对Vit C/Fe2+诱导线粒体脂质过氧化的影响

将大鼠脑组织按照 1/9的比例用线粒体提取Buffer匀浆,匀浆液 800×g,4℃离心 10 min,上清液再 8000×g,4℃离心 20 min,沉淀即为线粒体。用考马斯亮兰染色法测定线粒体蛋白含量,调整各样本的蛋白浓度均为 3 mg/mL。反应体系中含PBS缓冲液 270μL,100μL线粒体悬液和 10μL各浓度剃度的 L IG或 Vit E溶液,在 37℃下孵育 10 min。加入 10μL 2 mmol/L抗坏血酸 (Vitamin C,Vit C)和 10μL 25μmol/L FeSO4诱导脂质过氧化。用硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物丙二醛(MDA):加入0.4 mL浓度为2.8%三氯醋酸终止反应,再加入 1.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸试剂,于 95℃水浴保温 60 min,取出后立即置冷水中冷却。加入 2 mL甲醇和正丁醇的混合溶液 (15:85),振荡后4024×g,离心 30 min。吸取有机相 3 mL,于分光光度计 532 nm波长处比色,以空白管调零,测定吸光度值。抑制率按下式计算:抑制率 =(1-Ai/A0)× 100%。式中A0为空白对照组的吸光度,Ai为加入各浓度梯度的 L IG或 Vit E的吸光度。结果显示, L IG能明显抑制 Vit C/Fe2+刺激大鼠脑线粒体所引起的脂质过氧化反应,L IG含量升高,抑制作用增强,且呈剂量依赖性(表 1)。相同浓度的 L IG和Vit E(20 mmol/L)比较,L IG对 Vit C/Fe2+诱导线粒体脂质过氧化的抑制稍强于Vit E,但没有统计学意义(P>0.05)。

表 1 L IG对VitC/Fe2+诱导大鼠脑线粒体脂质过氧化的作用(±s,n=5)Table 1 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced by ascorbic acid/Fe2+system(±s,n=5)

表 1 L IG对VitC/Fe2+诱导大鼠脑线粒体脂质过氧化的作用(±s,n=5)Table 1 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced by ascorbic acid/Fe2+system(±s,n=5)

注:与空白对照组比较,＊＊＊P<0.001。Note:＊＊＊P<0.001vs control group.

组别Groups浓度(mmol/L) Concentration吸光度A532nm抑制率(%) Inhibition ratio Control – 0.094±0.004 –Vit E 20 0.075±0.002＊＊＊ 20.2±1.8 L IG 5 0.082±0.003＊＊＊ 12.8±3.5 20 0.064±0.005＊＊＊ 32.0±5.5 80 0.052±0.003＊＊＊ 47.5±3.1

表 2 L IG对NADPH诱导大鼠脑线粒体脂质过氧化的作用(±s,n=5)Table 2 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced byNADPH(±s,n=5)

表 2 L IG对NADPH诱导大鼠脑线粒体脂质过氧化的作用(±s,n=5)Table 2 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced byNADPH(±s,n=5)

注:与空白对照组比较,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。Note:＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001vscontrol group.

组别Groups浓度(mmol/L) Concentration吸光度A532nm抑制率(%) Inhibition ratio Control – –Vit E 20 0.076±0.003＊＊＊ 23.2±3.3 L IG 5 0.083±0.002＊＊ 16.2±2.4 20 0.064±0.006＊＊＊ 35.4±5.9 80 0.048±0.004＊＊＊ 51.5±4.4

2.3 对NADPH诱导线粒体脂质过氧化的影响

线粒体悬液的制备同 2.2。将 10μL各浓度剃度的L IG或Vit E溶液加入 100μL的线粒体悬液中,用 PBS调整体积为380μL,37℃温浴 10 min,加入 20μL 1 mmol/L NADPH诱导脂质过氧化,然后再 37℃温浴 30 min。用硫代巴比妥酸法测定并计算抑制率。结果显示,L IG能明显抑制NADPH刺激大鼠脑线粒体所引起的脂质过氧化反应,L IG含量升高,抑制作用增强,且呈剂量依赖性(表 2)。相同浓度的L IG和Vit E(20 mmol/L)比较,L IG对NADPH诱导线粒体脂质过氧化的抑制作用稍强于 Vit E,且具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 对大鼠脑、肝匀浆自发性脂质过氧化作用的影响

健康 SD大鼠,颈椎脱臼致死,迅速分离脑、肝组织,用冰冷的生理盐水制成 5%的匀浆。取 1.5 mL上述组织匀浆,加入 0.1 mL各浓度剃度的 L IG或Vit E溶液,对照管加 0.1 mL生理盐水,置 37℃振荡温育 1.5 h。用硫代巴比妥酸法测定并计算抑制率。结果表明,L IG在 5,20,80 mmol/L的药物浓度下,可以显著抑制大鼠脑、肝匀浆自发性脂质过氧化产物 MDA的生成 (与空白对照组比较,P<0. 05),且呈剂量依赖性(表 3)。

表 3 L IG对大鼠脑、肝匀浆液自发性脂质过氧化的作用 (±s,n=5)Table 3 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate(±s,n=5)

表 3 L IG对大鼠脑、肝匀浆液自发性脂质过氧化的作用 (±s,n=5)Table 3 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate(±s,n=5)

组别Group浓度Concentration (mmol/L)抑制率 Inhibition ratio(%)脑Brain 肝Liver Vit E 20 33.2±6.0 52.9±8.1 L IG 5 38.8±11.8 47.5±8.0 20 47.8±12.8 55.7±17.0 80 58.3±11.1 63.0±18.0

表 4 L IG对 H2O2诱导大鼠脑、肝匀浆液脂质过氧化的作用(±s,n=5)Table 4 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate induced by H2O2(±s,n=5)

表 4 L IG对 H2O2诱导大鼠脑、肝匀浆液脂质过氧化的作用(±s,n=5)Table 4 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate induced by H2O2(±s,n=5)

组别Group浓度Concentration (mmol/L)抑制率 Inhibition ratio(%)脑Brain 肝Liver Vit E 20 21.0±6.4 48.4±13.2 L IG 5 40.2±13.2 50.9±7.0 20 59.5±14.0 61.6±5.9 80 66.9±10.7 65.2±4.8

2.5 对 H2O2诱导大鼠脑、肝匀浆脂质过氧化作用的影响

组织匀浆液的制备同 2.4。取 1.5 mL脑和肝组织匀浆液,加入 0.1 mL各浓度剃度的 L IG或 Vit E溶液,对照管加 0.1 mL生理盐水,置 37℃振荡温育 30 min。加入5 mmol/L的H2O2诱导组织匀浆的脂质过氧化,然后再孵育 1h,用硫代巴比妥酸法测定并计算抑制率。结果表明,L IG在 5,20,80 mmol/ L的药物浓度下,可以显著抑制大鼠脑、肝匀浆H2O2诱导脂质过氧化产物MDA生成 (与空白对照组比较,P<0.05),且呈剂量依赖性(表 4)。

3 讨论

脂质过氧化物是生物膜和亚细胞膜中磷脂质所含多元不饱和脂肪酸被自由基损伤、氧化形成的过氧化产物,它可引起膜损伤、酶抑制、溶酶体释放、蛋白质交联、DNA和RNA结构破坏等生化毒性反应,造成多种疾病 (衰老、心血管病、炎症、肿瘤等)[2]。因此,研究药物有效成分的抗氧化作用对预防和治疗这些疾病可能发挥重要作用。

本研究采用的五种不同的脂质过氧化模型分别代表不同的激发体系。亚油酸自发氧化体系代表纯化学反应,Vit C/Fe2+激发体系代表非酶参与微粒体生物氧化反应,NADPH激发体系代表酶参与微粒体生物氧化反应,H2O2激发体系代表组织匀浆生物氧化反应,最后一种是组织匀浆的自发氧化体系。其中,VitC与与二价金属离子,通过 Fenton反应,生成O2-和·HO,这两种活性氧再进攻生物膜上的不饱和脂肪酸[3,4]。这五种脂质过氧化模型较为全面的体现了在环境有害物质的暴露条件下,人体内发生的一系列复杂的生物膜损伤机制,从而更简单有效地反映了药物的生物学保护机制。

藁本内酯经历了 40多年的研究,近年来随着其研究的深人,发现藁本内酯是一个很有发展前途的化合物,国外研究机构现对其十分关注[5]。在本研究中,藁本内酯对亚油酸、线粒体和组织匀浆的脂质过氧化均有明显抑制作用,且呈剂量依赖性,因而其全面的抗脂质过氧化作用得到证实,为其已为人知的药用价值提供了理论依据,为今后更为广阔的应用前景奠定了理论基础。

1 HuangWH(黄伟晖),Song CQ(宋纯清).Studies on the chemical constituents of Angelica sinensis.Acta Phar m Sin (药学学报),2003,38:680-683.

2 Hal iwellB,Gutteridge JMC.Free Radicals inBiology andMedicine.New York:Oxford University Press,1985.218-313.

3 Svingen BA,Buege JA,O’Neal FO,et al.The mechanis m of NADPH-dependent lipid peroxidation.J B iol Chem,1979, 254:5892-5899.

4 Morehouse LA,Bucher JR,Tien M,et al.Effect of hydrogen peroxide microsomal lipid peroxidation.B iochem Phar m acol, 1983,2:123-127.

5 Wang CY(汪程远),Du JR(杜俊蓉),Qian Z M(钱忠明). Advances in the study of Ligustilide.Chin Phar m J(中国药学杂志),2006,41:889-891.

Antilipoperoxidant Properties of L igustilide

LONG Rui1,2,DU Jun-rong2＊,WANGBei21The First Affiliated Hospital,Chongqing M edical University,Chongqing 400016,China;2Departm ent of phar m acology and biophar m aceutics,W est China School of phar m acy,Sichuan University,Chengdu 610041,China

This studywas conducted to investigated the antilipoperoxidant activities of ligustilide extracted fromAngelica sinensis,and vitamine E was used as the positive control.We established fivemodels:the spontaneousperoxidation of the linoleic acid emulsion,Vit C/Fe2+and NADPH induced lipid peroxidation of rat brain mitochondria,spontaneous and H2O2induced lipid peroxidation of rat tissue homogenate.L IG exhibited a significant concentration-dependant inhibition of lipid peroxidation in the linoleic acid,mitochondria and tissue homogenate.The resultsprovided experimental and theoretical basis for the research ofL IG.

ligustilide;antilipoperoxidant;vitamin E;linoleic acid;mitochondria

1001-6880(2010)02-0206-04

2009-03-30 接受日期:2009-06-05

＊通讯作者 Tel:86-23-89012401;E-mail:dujr 1@163.com

R282.71;Q949

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