N-CWS灌胃对小鼠移植性肿瘤及免疫功能的影响

张祝兰,唐文力,杨煌建,王 娟,洪金基

福建省微生物研究所,福州 350007

N-CWS灌胃对小鼠移植性肿瘤及免疫功能的影响

张祝兰＊,唐文力,杨煌建,王 娟,洪金基

福建省微生物研究所,福州 350007

为了考察红色诺卡氏菌细胞壁骨架(Nocardia rubracellwall skeleton,N-CWS)灌胃给药对小鼠的体内抑瘤效应及其免疫调节作用,采用小鼠肉瘤 S180的移植性肿瘤模型,检测 N-CWS灌胃给药的抑瘤活性;同时观察N-CWS体内细胞毒作用和对正常小鼠的毒性、免疫器官重量、巨噬细胞 (MΦ)吞噬功能及脾淋巴细胞转化的影响。结果显示,小鼠灌服N-CWS的 LD50>1.2 g/kg;N-CWS 200、400、800 mg/kg剂量灌胃小鼠对 S180有明显的抑制作用,其抑瘤率分别为 63.33%、71.11%、64.88%;与对照组比较,N-CWS可增加免疫器官重量和提升外周血白细胞数量、能明显提高小鼠MΦ的吞噬活性及显著提高淋巴细胞转化率(P<0.05),同时N-CWS激活了的MΦ对肿瘤细胞的细胞毒效应亦明显增强(P<0.05)。因此N-CWS适用于口服给药,对小鼠移植性肿瘤有明显的抑制作用,其抗肿瘤作用可能与增强机体免疫功能有关。

红色诺卡氏菌细胞壁骨架;抗肿瘤;免疫调节;给药途径

N ocardia rubra为诺卡氏菌属 (N ocardiofor m actinom ycetes)的红色诺卡氏菌,其细胞壁 (N-CWS)由诺卡氏菌酸、阿拉伯半乳聚糖和粘肽等组成[1]。Azuma等于 1976和 1978年相继报道了 N ocardia rubra细胞壁骨架 (N-CWS)注射给药的抗癌免疫佐剂活性[2,3]。研究表明,N-CWS适用于各种肿瘤引起的胸腹水的控制,肺癌、晚期胃癌和食道癌等的辅助治疗[4],但临床上注射给药可能出现局部皮肤红肿结节,溃疡,部分患者有发热反应等副作用[5],影响患者的继续治疗。本研究对小鼠灌胃给药 NCWS,考察其体内细胞毒作用和对小鼠的毒性、免疫活性及对小鼠移植性肿瘤的抑瘤效应等生物活性,并初步探讨其作用机理,旨在为其寻找最佳的给药途径提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与主要试剂

N-CWS(本所提供),ConA (SIG MA),MTT (SIG MA),DMSO为 AR,RPM I1640(G IBCO),中性红(上海试剂三厂)。

1.1.2 动物

ICR小白鼠(购自福建医科大学动物实验中心,雌雄各半,体重 18 g～22 g)。

1.1.3 瘤株

肉瘤 S180及艾氏腹水瘤 EAC(购自中国科学院上海药物所,福建医科所传代保种)。

1.1.4 仪器

双目显微镜 (OLY MPUS),XDS-1倒置显微镜(重庆光学仪器厂),酶标仪 (日本 B ID-RAD 550), CO2培养箱 (美国 Cole Parmer)。

1.2 方法

1.2.1 毒性试验

采用最大给药量法,20只小鼠,雌雄各半,体重18～22 g,给予N-CWS 30 mg/mL,每只小鼠灌胃 0. 80 mL,连续 14天观察小鼠出现的反应。

1.2.2 对小鼠移植性肿瘤的抑瘤试验

抽取生长 7d的 S180小鼠腹水调整成 5×106细胞/mL的悬液,小鼠右腋皮下接种 0.2 mL/只,接种次日开始给药。给药方法:试验组按不同剂量 (NCWS 200、400、800 mg/kg)每日定时灌胃给药 0.5 mL/只,连续 15 d。对照组灌胃等量生理盐水。停药次日解剖,取瘤称重,计算肿瘤生长抑制率。

1.2.3 体内细胞毒试验—W inn Test

小鼠灌胃给药方法同 1.2.2。停药次日处死小白鼠,无菌采取腹腔液,离心洗涤,镜检计数,活性在95%以上,调整巨噬细胞的浓度为 5×107/mL。将 5 ×107/mL MΦ悬液与艾氏腹水瘤 (EAC)细胞悬液(1×108细胞/mL)等量混合,取 0.2 mL接种至小鼠右腋皮下,第 14 d解剖,称瘤重。

1.2.4 免疫器官影响试验

小鼠灌胃给药方法同 1.2.2,停药次日眼眶采血,行外周白细胞计数,处死小白鼠,分别取出胸腺、脾脏并称重。

1.2.5 巨噬细胞(Macrophage,MΦ)功能影响试验

小鼠灌胃给药和制备 MΦ悬液方法分别同1.2.2和 1.2.3,调节悬液的MΦ浓度为 2×106/ mL。于 96孔培养板中每孔加 100μL,置 37℃、5% CO2培养箱培养 4 h,弃上清液,洗涤,加入一定量的0.075%中性红溶液,37℃、5%CO2培养箱培养 1 h。取出培养板,弃中性红,清洗,加入细胞裂解液150μL。静置过夜,测定 570 nm的吸光值 A570,A值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。

1.2.6 淋巴细胞转化影响试验

无菌取脾制单个细胞悬液,离心收集细胞,Tris-NH4Cl缓冲液溶解红细胞后离心洗涤,将细胞重悬于完全培养液。取一定浓度的悬液接种于 96孔板中(100μL/孔),同时加入一定量的N-CWS,设立 3复孔,另设培养液空白对照孔,细胞生长对照孔及Con A阳性对照孔,总量为 200μL/孔。于 5%CO2的饱和湿度培养箱中 37℃培养 72 h。每孔加入 15 μL MTT,继续培养 4 h,加入 100μL DMSO,测定波长为 570 nm处的吸光度 A570,计算淋巴细胞转化增强率。

2 结果

2.1 N-CWS的毒性

N-CWS样品以最大给药量给药,未见小鼠有任何异常,继续观察 14 d,小鼠未见任何毒性反应,结果表明口服N-CWSLD50>1.2 g/kg,提示N-CWS口服给药毒性低。

2.2 N-CWS的抑瘤作用

接种 S180次日开始连续灌胃给药 15 d进行治疗试验,结果见表 1。与对照组比较,治疗给药低剂量、中剂量和高剂量组对小鼠 S180的抑瘤率分别为63.33%、71.11%、64.88%,表明 N-CWS口服给药对 S180腹水型转实体瘤具有显著的治疗作用。

表 1 N-CWS对小鼠 S180的抑瘤作用Table 1 Effects of N-CWS on suppression of tumor growth of S180in mice

2.3 N-CWS的细胞毒作用

考察试验组和对照组 (巨噬细胞∶瘤细胞效靶比 =1∶2)的体内杀伤肿瘤细胞的功能,结果见表2,与对照组比较,试验低剂量组、中剂量组和高剂量组的瘤重均明显低于对照组,表明N-CWS口服给药具有提高对肿瘤细胞的细胞毒作用。说明 N-CWS活化的巨噬细胞明显增强抗瘤活性,提示其抗肿瘤过程中的非特异性免疫促进作用。

表 2 N-CWS对巨噬细胞抑瘤活性的影响Table 2 Inhibitory effects of N-CWS on the growth of EAC in vivo

2.4 N-CWS对免疫器官的影响

通过灌胃给药N-CWS免疫小鼠,采血,白细胞计数,并取出胸腺脾脏称重,结果见表 3。与对照组比较,低剂量组显著提高白细胞数量 (P<0.05),中剂量组显著提高白细胞数量和小鼠胸腺明显增重(P<0.05),高剂量组显著提高白细胞数量和小鼠胸腺脾脏均明显增重 (P<0.05),表明适当剂量的N-CWS明显增加胸腺脾脏重量和提升白细胞数量。提示N-CWS对小鼠免疫系统具有明显的刺激作用。

表3 N-CWS对小鼠免疫器官的影响Table 3 Effects ofN-CWS on immune organs ofmice

2.5 N-CWS对MΦ吞噬功能的影响

N-CWS连续定时灌胃给药 15 d,停药次日测定小鼠的MΦ吞噬中性红的作用,结果见表 4。与对照组比较,N-CWS低、中剂量组均具有明显地提高小鼠MΦ吞噬中性红的作用 (P<0.05),而高剂量组非常显著地提高小鼠MΦ吞噬中性红的作用 (P <0.01),说明N-CWS在一定剂量下具有明显的激活小鼠腹腔MΦ和机体应激能力,其激活小鼠腹腔MΦ和机体应激能力及提高机体免疫功能与剂量呈正相关。说明N-CWS口服给药具有提高小鼠MΦ的吞噬活性的功能。

表 4 N-CWS对小鼠巨噬细胞吞噬中性红的影响Table 4 Effects ofN-CWS on murine peritonealMΦphagocytic neutral red

2.6 N-CWS对淋巴细胞转化功能的影响

无菌制备浓度为 1×107/mL小鼠脾 T淋巴细胞悬液,于 96孔板中每孔加入 100μL悬液,同时加一定量的N-CWS,于 5%CO2的饱和湿度培养箱中37℃培养,采用MTT法测定波长为 570 nm处的吸光度,结果N-CWS组与Con A阳性对照组均明显提高小鼠脾淋巴细胞的增殖反应能力,见表 5。说明N-CWS具有促进 T淋巴细胞增殖的作用。

表 5 N-CWS对淋巴细胞转化功能的影响(n=5)Table 5 Effects ofN-CWS on lymphocyte transformation(n=5)

3 讨论

本课题组前期工作表明,注射给药N-CWS不但在实验模型而且在临床观察中都显示出增加宿主抗癌免疫功能而达到延长宿主生存期的作用。研究亦显示,具有抗肿瘤作用的N-CWS其机制与调节机体的免疫功能有关[6]。本实验尝试灌胃给药,结果证实N-CWS具有明显抑制 S180腹水型转实体瘤的作用。同时实验发现,以此给药方式N-CWS不仅对小鼠非特异性免疫功能有增强作用,而且对特异性免疫功能也有明显的促进作用。低剂量N-CWS即已显示明显的MΦ激活效果,在MΦ吞噬活性增强的同时促进胸腺和脾脏器官的增长、白细胞数量显著的提升,且提高 T淋巴细胞转化率,促进 T淋巴细胞的生成,提示在适当的剂量下N-CWS具有刺激 T细胞、NK细胞和B细胞的作用。体内W inn中和试验证实了经N-CWS口服给药激活的小鼠腹腔MΦ对肿瘤细胞的细胞毒效应明显增强,提示增强机体的细胞免疫功能是其抗肿瘤的重要机理。有关口服N-CWS促进白细胞介素-2和肿瘤细胞坏死因子-α生成等研究工作我们也将后续展开,为进一步阐明N-CWS提高机体免疫抗肿瘤的作用机制和开发NCWS口服给药的临床应用提供更多的理论依据。

1 Zhang ZL(张祝兰),Lin S(林善),TangWL(唐文力),et al.Studies on the physico-chemical properties,composition and content determination ofNocardia rubracell wall skeleton.Chin J Antibiotics(中国抗生素杂志),2002,27:532-534.

2 Azuma I,Taniyama T,YamawakiM,et al.Adjuvant and antitum or activities ofNocardia rubracellwall skeletons.Gann, 1976,67:733-736.

3 Azuma I,YamawakiM,Yasumoto K,et al.Antitumor activity ofNocardia rubracell wall skeleton preparation in transplantable tumors in syngeneic mice and patients with malignant pleurisy.Cancer Imm unol Imm unother,1978,4:95-100.

4 Ye BP(叶波平),Wang Y(王颖),Jin GQ(金国虔),et al. A new way ofNocardia rubracellwall skeleton(N-CWS)in treating liver disease(红色奴卡氏放线菌细胞壁骨架用于治疗肝脏疾病的新用途).CN100341574C,2007-10-10.

5 Li H(李惠).Observation and nursing of N-CWS in treating malignant hydrothorax.Practical J Cardiac Cerebral Pneum al and VascularD isease(实用心脑肺血管病杂志),2003,11: 308-309.

6 Lin YX(林跃鑫),Sheng Y(盛盈),Lu ZX(路歧详),et al. Inhibitory Effect ofNocardia rubracell wall skeleton(NCWS)on mice bearing lewis lung carcinoma.J Fujian Normal Univ(福建师范大学学报),2003,19(3):67-69

Effect ofNocardia rubraCellWall Skeleton(N-CW S)on Transplanted Tumor and Immunological Function in M ice Given Through Oral Adm in istration

ZHANG Zhu-lan＊,TANGWen-li,YANG Huang-jian,WANG Juan,HONG Jin-ji
Fujian Institute of M icrobiology,Fuzhou 350007,China

Itwas studied the effect ofNocardia rubracellwall skeleton(N-CWS)on transplanted tumor and immunological function in mice given in oral administration.Transplanted tumormodel of sarcoma 180 in mice was used to evaluate the antitumor effect ofN-CWS.Meanwhile the immune organ weights,the phagocytosis of peritonealmacrophage and the lymphocyte transfor mation were determined in nor malmice.After oral administration ofN-CWS 200,400,800 mg/kg to mice,the inhibition rates on sarcoma 180 were 63.33%,71.11%,64.88%.The medial lethal dose(LD50)of N-CWS wasmore than 1.2 g/kg.Comparedwith control group,the spleen and thymusweights in nor malmicewere increased obviously(P<0.05),the lymphocyte transfor mation and the phagocytosisofperitonealmacrophage from micewere also increased(P<0.05).In conclusion,N-CWS could be given via oral administration.It has the antineoplastic effect,partially,by enhancing immunological function.

N-CWS;antitumor;immunological function;drug administration route

1001-6880(2010)02-0228-04

2009-03-19 接受日期:2009-05-18

福建省自然科学基金项目(2007J0248)

＊通讯作者 Tel:86-591-83470740;E-mail:jessylan9963@sina.com

R392;Q58

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