无花果枝提取物体外诱导胃癌BGC-823细胞凋亡的研究

解美娜,李锋杰

潍坊医学院医学研究实验中心,山东 261053

无花果枝提取物体外诱导胃癌BGC-823细胞凋亡的研究

解美娜＊,李锋杰

潍坊医学院医学研究实验中心,山东 261053

为探讨新鲜无花果枝提取物(FBE)对体外培养的人胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响,用不同浓度 FBE处理胃癌BGC-823细胞,采用细胞形态学观察,细胞活力测定 (MTT法)及免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况来评价 FBE对BGC-823细胞体外增殖的影响,应用流式细胞术的膜联蛋白V/碘化丙啶技术(Annexin V/PI法)检测 FBE诱导 BGC-823细胞体外凋亡的情况。形态学观察发现中高剂量 (>0.5 mg/mL)组处理 4 h细胞出现明显凋亡,24 h检测到中高剂量 (>0.5 mg/mL)组细胞增殖活力和增殖细胞核抗原表达显著降低(P<0.05),流式细胞仪检测到 FBE处理 4 h所有剂量组细胞平均凋亡率 (9.76%,10.87%, 14.29%,49.67%,71.37%)均高于对照组 (6.1%)(P<0.05或 P<0.01),以上作用效果呈现剂量依赖性。以上结果说明无花果枝提取物能够通过诱导胃癌BGC-823细胞凋亡从而抑制其体外的生长与增殖。

无花果枝提取物;胃癌细胞;增殖;凋亡

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年升高[1],严重危害人类的健康和生活质量。化疗是胃癌的主要治疗手段之一,但是目前常用方案的化疗效果并不太理想,因此寻找有效的治疗胃癌或延长胃癌患者生存期的传统中药成为临床治疗所必需。无花果系桑科无花果属植物 (Ficus caricaI),其果实含有多种人体所需的维生素、氨基酸、酶类以及微量元素,可以药食两用[2]。近年来的研究表明,无花果具有抗疲劳、抗衰老[3]、抗病毒[4,5]、抗肺癌[6]等作用,对胃溃疡也有显著疗效[6]。目前大部分研究集中在对无花果果实和叶的研究[3,6,8],还未见对无花果枝抗癌方面的研究,本实验以人胃癌细胞株 SGC-823为靶细胞,探讨无花果枝提取物(FBE)对肿瘤细胞的生长抑制及诱导细胞凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

人胃癌细胞株 BGC-823购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.1.2 主要试剂

培养液 RPM I-1640细胞培养液购自 Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝购自 SIG MA公司;Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司;PCNA一抗及免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉公司;无花果枝五月初采自烟台。

1.1.3 主要仪器

FACS Calibur流式细胞仪为BD公司产品;CO2培养箱为热电公司产品;倒置相差显微镜和照相系统为LEI CA公司产品;全波长酶标仪为基因公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 无花果枝提取物制备

无花果枝 60 g,切碎,加入蒸馏水 300 mL,煮 40 min,将水溶液离心 4000 r/min×10 min,取上清,用冷冻干燥机冻干成粉末状,-20℃保存,用前用 RPM I-1640培养液稀释,离心 8000 r/min×10 min,两次,取上清,0.22μm滤膜过滤,备用。

1.2.2 细胞培养

将冻存细胞复苏后,加入适量 RPM I-1640培养液(含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)接种于培养瓶或 96孔培养板中。放培养箱(37℃,5%CO2)中培养,每隔 2～3 d传代 1次。选对数生长期细胞用于实验,细胞浓度为 2×105个/mL。细胞贴壁后加入不同浓度 FBE(0、0.025、0.25、0.5、1.0、2.5 mg/mL),每种剂量设四个重复。观察细胞生长增殖状况及形态变化,并拍照。

1.2.3 细胞增殖活力检测(MTT法)

FBE处理 24 h后,加入MTT(0.25 mg/mL)后放入 37℃,5%CO2培养箱中继续培养 4 h,吸除培养液,每孔加入 100μL DMSO溶解紫色颗粒,然后用酶标仪测 570 nm下的吸光度 (OD)值,实验重复三次。

1.2.4 PCNA免疫细胞化学

培养 24 h的细胞用 PBS洗 15 min(5 min×3),用冷甲醇/丙酮固定液(3:1)固定 20 min,晾干。3%H2O2孵育 10 min灭活内源性酶,蒸馏水冲洗, PBS浸泡 10 min。滴加山羊血清封闭液,室温 20 min,甩去多余液体,不洗。滴加小鼠抗 PCNA抗体, 4℃过夜,PBS(pH 7.2～7.6)洗 2 min×3。滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG,37℃孵育 20 min,PBS洗 2 min×3。滴加试剂 SABC,37℃孵育 20 min,PBS洗5 min×4。DAB显色。

1.2.5 Annexin V/PI法检测细胞凋亡

不同浓度 FBE作用 4 h后收获细胞移入试管, PBS洗涤 1次,400μL Binding Buffer重悬细胞。取200μL细胞悬液加入AnnexinV 5μL,PI10μL避光20 min,加入 200μL Binding Buffer上流式细胞仪检测。用 Cellquest软件获取数据,用ModFit软件进行数据分析。

1.2.6 统计学处理

所得数据采用 SAS(6.12版本)软件中 GLM过程进行方差分析及Duncan’s进行多重比较,检验误差为5%和1%水平。

2 结果

2.1 FBE对BGC-823细胞形态的影响

FBE处理组(>0.5 mg/mL)胃癌细胞生长受到抑制,并出现凋亡现象,倒置显微镜下正常组细胞多呈多角形贴壁生长,而加入 FBE处理 4 h,细胞即出现胞浆空泡化,核固缩 (图 1),24 h后细胞变圆,脱壁,低剂量组未见明显改变。

图 1 不同浓度 FBE处理4 h后BGC-823细胞形态学变化Fig.1 Morphology changes of BGC-823 cells after treatment by different concentration of FBE for 4 h

2.2 FBE对BGC-823细胞增殖的影响

2.2.1 FBE抑制BGC-823细胞增殖活力

FBE对人胃癌细胞增殖有抑制作用,并呈剂量效应关系,当浓度高于 0.5 mg/mL时,具有显著抑制作用(P<0.05)(图 2)。

图2 不同浓度 FBE处理BGC-823细胞24 h细胞增殖活力与 0 mg/mL组比较的变化Fig.2 Proliferating activity changes ofBGC-823 cells after treatment by different concentration of FBE for 24 h contrastwith 0 mg/mL group

2.2.2 FBE对 PCNA表达的影响

免疫组织化学结果表明,处理组细胞 (0.5, 1.0,2.5 mg/mL剂量组)比对照组阳性细胞减少,其阳性率 (分别为 85.2% ±0.76%,80.1% ±1. 56%,72.4%±1.5%)比对照组阳性率 (95.3% ± 2.3%)显著降低 (P<0.05)。

2.3 FBE诱导人胃癌细胞早晚期凋亡的变化

在凋亡的早期阶段,胞浆膜磷脂的不对称性丧失,导致膜内侧磷脂酰丝氨酸 (PS)从细胞膜内层暴露于外层,从而可被 PS特异的Annexin V探针所标记。流式 Annexin V-FITC/PI双参数图上 (图 3)可见,早期凋亡细胞位于右下象限(FITC+,PI-),晚期凋亡细胞位于右上象限 (FITC+,PI+),左下象限为活细胞 (FITC-,PI-),左上象限为坏死细胞(FITC-,PI+)。不同浓度的 FBE在 4 h即可诱导胃癌细胞发生早期凋亡,随着剂量增加早期凋亡细胞不断增加,并逐渐向晚期凋亡过渡,不同剂量 (0、0.025、0.25、0.5、1.0、2.5 mg/mL)平均凋亡率分别为 6.1%,9.76%,10.87%,14.29%,49.67%, 71.37%。不同浓度无花果枝提取物诱导的细胞凋亡与对照组相比差异均有显著性意义 (P<0.05,P <0.01)(图 4)。

3 讨论

图 3 流式细胞仪检测不同浓度 FBE处理 4 h BGC-823细胞的凋亡情况Fig.3 Apoptosis ofBGC-823 cells detected by FCM after trea tment by different concentration of FBE for 4 h

近年我国各类癌症发病率日益上升,迫切需要研发出既能抑制癌细胞增殖甚至凋亡而又对人体危害较少的药物,因此开发天然抗癌药物成为研究热点。由于无花果含有多种不同生物活性的化学成分,近年来对无花果的研究日益增多,但多集中在对其果实、果浆、根和叶的研究上,其叶的提取物具有抗新城疫病毒、单纯疱疹病毒和抑菌活性[7,8],其果实提取物和果浆能诱导多种肿瘤细胞和癌细胞的凋亡[9,10]。但是目前对无花果枝的研究还很少,由于枝比果实和叶的存活时间长,突破了对季节的依赖性且更容易大量获取,因此具有重要的研究价值。本实验采用冷冻干燥机冻干成粉末冷冻保存,可尽可能减少保存对其效果的影响并保证剂量的准确性。

图 4 流式细胞仪检测不同浓度 FBE处理 4 h BGC-823细胞的早晚期平均凋亡率Fig.4 Early and late apoptosis of BGC-823 cells detected by FCM after treatment by different concentration of FBE for 4 h

本实验通过观察 FBE对胃癌细胞株 BGC-823体外生长、增殖、凋亡的影响,通过检测细胞增殖活力,免疫组织化学法检测 PCNA的表达量变化以及流式细胞仪检测细胞凋亡情况,探讨了 FBE对胃癌细胞株BGC-823的生长抑制及凋亡作用。虽然低浓度剂量组在形态上和细胞活力检测的结果中作用不是很明显,但是流式的检测结果表明,当浓度低至0.025 mg/mL时,无花果枝提取物作用 4 h对BGC-823细胞仍具有诱导凋亡的作用。可能是因为此时细胞处于早期凋亡阶段,在形态方面和酶代谢方面改变不是很明显,这也证实应用流式细胞仪的检测早期凋亡比形态学和酶学更加灵敏。同时药物剂量的降低也避免了对培养体系渗透压、PH值等其它因素的改变,更加有力证实了无花果的真实效果。

本实验结果表明,FBE对胃癌细胞株 BGC-823体外增殖具有明显抑制作用,可能是通过诱导BGC-823细胞凋亡实现的。在凋亡早期细胞膜完整而磷脂酰丝氨酸(PS)膜外翻现象,而到晚期细胞膜完整性被破坏,凋亡细胞裂解成凋亡小体,通过诱导肿瘤细胞凋亡可以来达到治疗肿瘤的目的。因此有关无花果枝水提取物抑制胃癌细胞生长增殖以及诱导凋亡机制的基础研究,对于临床应用的指导意义十分重要,还有待进一步研究。

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Apoptosis of Human Gastric Cancer L ine BGC-823 Induced by Fig Branch Extract

XIEMei-na＊,L I Feng-jie
M edicine Experiment Center,W eifang M edical University,Shandong 261053,China

To illustrate the growth inhibition and apoptosis in human gastric cancer BGC-823 cells treated with Fig Branch extract(FBE),morphologic changes of gastric cellswere observed under an inversion microscope,colony formation inhibition and immunohistochemical staining detecting the expression of PCNA were used to reveal the effectof FBE on proliferation ofBGC-823 cells,and flow cytometrywas used to determine the apoptosisof cells byAnnexinV/PIassay after treated with various concentration of FBE in vitro.Morphologic alterations of cells were observed after treated with middle dose and high dose(>0.5 mg/mL)of FBE for four hours.Cellproliferation was inhibited and the expression of PCNA in the cellswere decreased bymiddle dose and high dose(>0.5 mg/mL)of FBE(P<0.05).Flow cytometry analysis revealed significantly greater increase in apoptosis cells(9.76%,10.87%,14.29%,49.67%,71.37%)contrastwith control group(6.1%)after treatment with all doses of FBE for four hours(P<0.05 orP<0.01).Fig branch extractmay inhibit the growth and proliferation of human gastric cancerBGC-823 cells through inducing cell apoptosis.

fig branch extract;gastric cancer cell;proliferation;apoptosis

1001-6880(2010)02-0219-04

2009-03-31 接受日期:2009-07-20

潍坊医学院青年教师启动基金(KQ07004)

＊通讯作者 Tel:86-536-8462462;E-mail:xiemeina@wfmc.edu.cn

Q946.91;R285

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