陈平 姚玮艳 章永平 乔敏敏 袁耀宗
·论著·
雨蛙素诱导的急性胰腺炎体外细胞模型的信号转导通路研究
陈平 姚玮艳 章永平 乔敏敏 袁耀宗
目的观察急性胰腺炎(AP)体外细胞模型Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)信号转导通路及细胞因子表达的变化,探讨其机制。方法应用雨蛙素处理大鼠胰腺外分泌细胞株AR42J细胞建立AP体外模型,再用雷帕霉素 (RPM) 及AG490干预。采用Western blotting检测细胞JAK1、磷酸化JAK1(P-JAK1)、STAT1、P-STAT1及TNF-α、 IL-1β、IL-6蛋白表达水平;RT-PCR检测TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA表达;台盼蓝染色测定细胞存活率。结果未经雨蛙素处理的AR42J细胞的JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1及TNF-α、 IL-1β、IL-6蛋白的相对表达量分别为0.09±0.04、0.14±0.08、0.21±0.09、0.12±0.12、0.10±0.02、0.08±0.03、0.02±0.02。雨蛙素处理后,AR42J细胞上述蛋白的表达呈时间依赖性增加,24 h时的表达量分别为0.53±0.09、0.53±0.13、0.56±0.09、0.55±0.10、0.25±0.04、0.25±0.09、0.27±0.07,均较雨蛙素未处理组显著增加(P<0.05)。再分别应用RPM和AG490抑制24 h后, 细胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达量显著降低到0.17±0.03和0.17±0.01、0.15±0.05和0.14±0.07、0.19±0.04和0.19±0.05,它们的mRNA 表达量也显著降低(P值均<0.05);RPM和AG490抑制组的细胞存活率分别为(72.4±11.2)%、(69.7±9.8)%,均显著高于单用雨蛙素处理细胞组的(42.2±12.3)%(P<0.05)。结论JAK1/STAT1信号通路早期参与雨蛙素诱导的AP细胞促炎症细胞因子释放。早期抑制JAK1/STAT1信号通路有利于控制AP的炎症反应。
胰腺炎; Janus激酶1; 信号转导和转录激活子1; 炎症; 细胞因子类
Janus激酶 (Janus kinase,JAK)和转录激活子(Signal transducer and activator of transcription, STAT) 信号转导通路作为细胞间信号转导的重要通路,参与细胞凋亡、急性肺损伤、脓毒性休克等病理过程[1]。本实验应用雨蛙素处理大鼠胰腺外分泌细胞株AR42J细胞构建体外急性胰腺炎(AP)模型,观察JAK/STAT信号转导通路主要蛋白JAK1、STAT1和主要促炎症相关细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达的相关性,从而揭示治疗疾病的新靶点。
一、细胞株的培养和实验分组
大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞株购自美国ATCC公司,常规传代培养。实验前将细胞接种于25 ml培养瓶中培养24~72 h,分为PBS对照组、雨蛙素(10-8mol/L)处理组(雨蛙素组)、雷帕霉素(RPM, 50 ng/ml)+雨蛙素(10-8mol/L)处理组(RPM组)和AG490(50 μmol/ml)+ 雨蛙素(10-8mol/L)处理组(AG490组)。雨蛙素培养6、12、24、48 h分批收获细胞,后两组培养24 h收获细胞。每组设3个样本,实验重复3次。
二、JAK1、磷酸化-JAK1(P-JAK1)、STAT1、P-STAT1、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白检测
先用RIPA分裂液(申能博彩公司) 抽提各组细胞总蛋白,采用BCA法行蛋白的定量 (Pierce公司)。然后采用常规Western blotting方法检测蛋白表达,以GAPDH作为内参照。抗JAK1、P-JAK1、STAT、P-STAT1 一抗(cell signaling 公司)工作浓度为1∶1000;抗TNF-α、IL-1β、IL-6一抗(Santa cruz公司)工作浓度为1∶200;抗GAPDH一抗(上海康成公司)工作浓度为1∶10 000。ECL(Amersham Biosciences公司)发光后,压片、冲洗、显影。采用Bio-Rad公司数码成像系统对图片进行扫描,Quantity One软件灰度分析,以目的条带与GAPDH条带灰度值比作为目的蛋白相对表达量。
三、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA检测
应用Trizol试剂 (Invitrogen公司)提取细胞总RNA。应用Primer 5程序设计引物:IL-6上游5′-TGCCTTCTTGGGACTGAT-3′,下游5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3′;IL-1β上游5′-TCTGTGACTCGTGGGATG-3′,下游5′-TCTTTGGGTATTGTTTGG-3′;TNF-α上游5′-TCTCATTCCTGCTCGTGG-3′,下游5′-CCATTGGCCAGGAGGGCGTTGG-3′;内参GAPDH上游5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTC-3′,下游5′-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。引物由上海英骏生物公司合成。采用M-MLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生物工程技术有限公司)合成cDNA。RT-PCR检测mRNA 表达。PCR反应条件:94℃ 4 min,94℃45 s、55℃(GAPDH)或58℃(IL-6、IL-1β)或60℃(TNF-α)45 s、72℃45 s, 35个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离,Bio-Rad凝胶成像系统摄影,Quantity One软件灰度分析,以目的基因mRNA与GAPDH mRNA灰度比值作为mRNA相对表达量。
四、细胞存活率检测
采用台盼蓝染色试剂盒(碧云天生物公司),严格按说明书操作。细胞存活率=(细胞总数-坏死细胞数)/细胞总数× 100%
五、统计学方法
一、JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1蛋白表达
雨蛙素组JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1蛋白表达呈时间依赖性增加(图1), JAK1于6 h,P-JAK1、STAT1、P-STAT1于12 h表达均显著高于对照组(P值均<0.05,表1)。
图1雨蛙素组和对照组JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1蛋白表达(Western blotting)
二、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达
雨蛙素组IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达也呈时间依赖性增加(图2)。IL-1β、TNF-α在6 h,IL-6在12 h的表达较对照组显著增加(P值均<0.05,表1)。
图2雨蛙素组和对照组IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达(Western blotting)
三、STAT抑制剂RPM及JAK抑制剂AG490对雨蛙素组细胞IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA表达的影响
RPM、AG490 处理雨蛙素组细胞后,细胞的IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA表达均较雨蛙素未处理组显著降低(P值均<0.05,图3、表2),但两处理组间差异无统计学意义;此外,两处理组细胞IL-6蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05)。
图3各组细胞IL-6 、IL-1β、TNF-α蛋白(a)和mRNA(b)表达
四、细胞存活率
对照组、雨蛙素组、RPM组和AG490组细胞培养24 h后,细胞存活率分别为(80.4±7.2)%、(42.2±12.3)%、(72.4±11.2)%和(69.7±9.8)%,雨蛙素组较对照组明显降低(P<0.05),RPM组和AG490组较雨蛙素组显著增高(P<0.05),与对照组无显著差异(P>0.05)。
表1 雨蛙素处理前、后AR42J细胞JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达的变化
注:与对照组比较,aP<0.05;与6 h组比较,bP<0.05
表2 RPM、AG490处理24 h后各组AR42J细胞IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA表达的变化
注:与雨蛙素组比较,aP<0.05;与对照组比较,bP<0.05
Robinson等[2]报道,TNF-α处理胰腺腺泡细胞后细胞STAT1、STAT3蛋白表达增高;而YY肽抑制STAT1、STAT3蛋白表达,并减轻其诱导细胞因子的释放。Gallmeier等[3]报道,干扰素γ可诱导胰腺腺泡细胞JAK2和STAT1蛋白的活化表达。Simovic等[4]通过构建AP肺损伤动物模型,发现STAT6敲除小鼠于制模后1~6 h出现肺损伤,但12 h后损伤减轻;而STAT4敲除小鼠于制模后1~6 h仅出现轻度肺损伤, 12 h后损伤加重,但均较野生型小鼠的肺损伤有所减轻,提示STAT参与AP肺损伤机制,但不同类型的STAT的作用有所不同。本实验通过雨蛙素处理胰腺腺泡细胞株AR42J建立AP的体外模型[5],结果显示JAK1及STAT1表达和活化呈时间依赖性增加,也证明JAK1/STAT1信号转导通路参与雨蛙素诱导的胰腺细胞损伤机制。
IL-1β、TNF-α是触发失控性炎症反应的关键促炎症细胞因子之一[6-7]。本实验结果显示,雨蛙素处理后AR421细胞IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达均与JAK1、STAT1蛋白表达同步增高,提示在AP中促炎症细胞因子的表达可能与JAK1/STAT1信号转导通路的活化有关。
RPM是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂,通过阻断STAT上酪氨酸残基的磷酸化而抑制激酶的激化,进而调控下游基因表达和蛋白合成[8]。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二睛的脂类衍生物,通过阻断JAK 701位酪氨酸或727位丝氨酸磷酸化,从而阻断下游激酶的活化进而抑制细胞因子的生理和病理效应[9]。
本实验使用RPM和AG490处理雨蛙素诱导的AR42J细胞,结果显示培养24 h后细胞IL-6、IL-1β、TNF-α表达均较雨蛙素组细胞明显下调,细胞的存活率显著增加,提示负性调控JAK1/STAT1信号转导通路可抑制病程中促炎症细胞因子的释放,减轻雨蛙素诱导的胰腺细胞损伤。
[1] O′shea JJ.Targeting the Jak/STAT pathway for immunosuppression.Ann Rheum Dis,2004, 63: 67-71.
[2] Robinson K,Vona-Davis L,Riggs D,et al.Peptide YY attenuates STAT1 and STAT3 activation induced by TNF-alpha in acinar cell line AR42J.J Am Coll Surg,2006,202:788-796.
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2009-08-14)
(本文编辑:吕芳萍)
Expressionofjanuskinase1/signaltransducerandactivatoroftranscription1signalingpathwayinceruleanstimulatedpancreaticacinarcells
CHENPing,YAOWei-yan,ZHANGYong-ping,QIAOMin-min,YUANYao-zong.
TheDepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China
YUANYao-zong,Email:yyz28@medmail.com.cn
ObjectiveTo investigate the relationship between the activity of Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signaling pathway in cerulein-induced pancreatic acinar cell line AR42J.MethodsThe in vivo model of AP was induced by cerulean treated pancreatic acinar cell line AR42J, then RPM and AG490 were given for intervention. Western blot was used to determine the expressions of JAK1 and phosphorylation JAK1 (P JAK1), STAT1, PSTAT1 and TNFα, IL-1β, IL-6. The expressions of IL-6, IL-1β, and TNFα mRNA were measured by RT-PCR. Survival rate of cells was evaluated by trypan blue stain.ResultsThe relative expressions of JAK1, P JAK1, STAT1, P STAT1 and TNF-α, IL-1β, IL 6 without cerulean treatment were 0.09±0.04,0.14±0.08,0.21±0.09,0.12±0.12,0.10±0.02,0.08±0.03,0.02±0.02. After cerulean treatment, the expressions of abovementioned protein increased in a time-dependant manner, the expressions at 24h were 0.53±0.09,0.53±0.13,0.56±0.09,0.55±0.10,0.25±0.04,0.25±0.09,0.27±0.07, which were significantly higher than those in the control group (P<0.05). 24 h after RPM and AG490 inhibition, the expressions of TNF-α, IL-1β, IL-6 proteins significantly decreased to 0.17±0.03and0.17±0.01,0.15±0.05and 0.14±0.07, 0.19±0.04and0.19±0.05; their expressions of mRNA significantly decreased (P<0.05). The cell survival rates in RPM and AG490 treatment group were (72.4±11.2)%, (69.7±9.8)%, and in cerulein-stimulated cells (42.2±12.3)% (P<0.05).ConclusionsThe JAK1/STAT1 signaling pathway was involved in pancreatic inflammatory response with cerulein stimulation. Early treatment with inhibitors to the JAK1/STAT1 signaling pathway might control the inflammatory response in acute pancreatitis.
Pancreatitis; Janus kinase 1; Signal transducer and activator of transcription 1; Inflammation; Cytokines
10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.015
200025 上海,上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科
袁耀宗,Email:yyz28@medmail.com.cn