李兴华 方德宁 沈奕 曾钗明 邓淑娟
·论著·
胰腺癌患者血清相关蛋白质差异表达的研究
李兴华 方德宁 沈奕 曾钗明 邓淑娟
目的利用肿瘤血清蛋白质组分析方法(serologic proteome analysis,SERPA)对胰腺癌患者血清和正常人血清进行蛋白质组的分析,寻找胰腺癌特异的肿瘤标记物。方法利用HPLC柱去除血清中的白蛋白,通过双向电泳分离蛋白质,经图像采集与分析,切取胰腺癌患者血清和正常人血清的差异蛋白质点,进行质谱分析鉴定。结果共获得4个差异蛋白质。正常人血清含量高而胰腺癌患者血清含量低的蛋白质为胍裂解环化酶激活蛋白2(guanylate cyclase-activating protein 2)。胰腺癌患者血清含量高而正常人血清含量低的蛋白质3个,分别为结合珠蛋白2α(haptoglobin 2 alpha)、转甲状腺素蛋白(transthyretin)及KIAA1018蛋白。结论KIAA1018有望成为胰腺癌筛选和早期诊断的肿瘤标记物。
胰腺肿瘤; 蛋白质组学; 血清蛋白质类; 肿瘤标记,生物学
胰腺癌的早期诊断是提高患者存活率的关键。为寻找胰腺炎特异性肿瘤标记物,提高早期诊断率,目前的研究主要是针对胰腺癌的致病基因及单个蛋白质的分析。蛋白质组学(proteomics)的出现为寻找肿瘤标记物带来了希望[1],而肿瘤血清蛋白质组分析法(serologic proteome analysis,SERPA)更是寻找肿瘤相关抗原的理想手段[2]。本实验应用SERPA分析胰腺癌患者和正常人血清中蛋白质表达的差异,为寻找胰腺癌特异的肿瘤标记物奠定基础。
一、材料及实验仪器
胰腺癌患者血清由长海医院消化内科提供。正常人血清为健康的献血者。
固相线性pH梯度干胶条(Immobilized DryStrips,pH3-10,13cm)及N、N-甲叉双丙烯酰胺均购自Amersham Biosciences公司,甘油、TEMED、过硫酸胺、EDTA购自Sigma公司。蛋白酶抑制剂购自Roche公司。碘乙酰胺购自Fluka Biochemika公司。去除血清中白蛋白的HPLC柱购自BIO-RAD公司。
组织匀浆仪(Homogenizer Glas-Col USA)、高速低温台式离心机(UNIVERSAL 16R ZENTRIFUGEN)、紫外可见光分光光度计(SECOMAN France)、IPGphor固相pH梯度电聚焦电泳仪、Electrophoresis Power Supply EPS 3501 XL、垂直电泳系统(Hoefer Electrophoresis Unit SE600 series)均购自Amersham Biosciences公司。
二、方法
1.标本制备:将HPLC柱(5 ml)事先用0.02 mol/L Na2HPO4(pH 7.1)20~50 ml冲洗、浸泡。将正常血清和胰腺癌患者血清各5 ml分别按0.5 ml/min速度过柱,取过柱后的后面3 ml血清,一部分用于检测血清白蛋白,另一部分备用。
2.双向电泳:取除去白蛋白的癌血清及正常血清200 μl,加入DNAse和RNAse各2 μl,与重泡胀液(8 mol/L Urea,2%CHAPS,18 mmol/L DTT,0.5% IPG Buffer,Bromophenol blue trace)50 μl混合,泡涨pH 3~10干胶条(13 cm长),12 h。等电聚焦程序为500 V 1 h→1000 V 1 h→1500 V 3 h→3500 V 8 h,总电压时间乘积为30 kVh。等电聚焦后,将IPG胶条放入平衡缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8,6 mol/L Urea,30% Glycerol,2% SDS,trace bromophenol blue)进行平衡后水平放于12.5% SDS凝胶的顶端进行垂直电泳。
3.蛋白质染色:采用Amersham Biosciences公司提供的染色方案进行考马斯亮蓝染色,银染按文献报道优化进行[3]。
4.图像采集与分析:染色后的凝胶用PowerLook 2100XL扫描仪扫描,并采用Image Master 2D Elite图像分析软件分析。
5.MALDI-TOF MS 质谱分析:应用ABI的Proteomics System I(上海基康公司)分析,使用胰岛素自我分解峰为内参照,混合标准肽为外标校正。质谱参数为:离子源加速电压为20 kV,激光波长为337 nm,脉冲宽度为3 ns。离子延迟提取100 ns。
6.数据库检索: 获得的肽片断质量数据用Protein Prospector中的MS-FIT工具在NCBI的nr(10.15.2003)数据库中检索。检索参数为:最大允许的肽质量误差为0.1 u,每个肽允许有2个不完全裂解位点,等电点设置为3~10,分子质量根据二向电泳提供的表观分子质量加减10 000作为其范围。
一、双向电泳结果
5例正常人血清和5例胰腺癌患者血清经双向电泳分离,一块胶经银染后大约可见300~500个蛋白质点(图1),图像分析不同标本、相同组织蛋白质的点基本稳定,可重复的蛋白质点在95%以上。
图1 血清蛋白的双向电泳银染图
二、正常人及胰腺癌患者血清蛋白质的差异
正常人血清与胰腺癌患者血清有4个含量差异明显的蛋白质点。经质谱分析鉴定(图2),分别为胍裂解环化酶激活蛋白2(guanylate cyclase-activating protein 2)、结合珠蛋白2α(haptoglobin 2 alpha)、转甲状腺素蛋白(transthyretin,or prealbumin, amyloidosis type Ⅰ)、KIAA1018蛋白。正常人血清guanylate cyclase-activating protein 2含量明显高于胰腺癌患者;而其他3种蛋白,胰腺癌患者血清含量明显高于正常人。
a:胍裂解环化酶激活蛋白2;b:结合珠蛋白2α;c:转甲状腺素蛋白;d:KIAA1018蛋白
图2质谱分析图
已有文献报道[4-5],应用肿瘤血清蛋白质组分析方法对肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、肾细胞癌、肝癌以及卵巢癌等多种肿瘤患者血清进行分析。 本研究对胰腺癌患者血清进行蛋白质组分析,共发现4个差异蛋白质。
结合珠蛋白属于α2球蛋白组分中的一种糖蛋白,由位于16号染色体长臂上的两个等位基因所编码。它能与血红蛋白稳定结合,具有遗传多态现象,是血清遗传学的一个重要标志物[6]。Awadallah等[7]报道,结合珠蛋白基因和恶性淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌等发生有一定的关系。结合珠蛋白具有非特异性免疫防御功能,可抑制流感病毒的血凝集反应,对那些生长和繁殖过程中需要亚铁血红素的致病菌亦有抑制作用。此外,结合珠蛋白还是前列腺素合成酶复合物的内源性抑制物;结合珠蛋白与血红蛋白复合物还可刺激胶原的合成。结合珠蛋白的合成与分解主要在肝脏进行,正常情况下,能保持相对的动态平衡,但在动脉硬化、溶血性贫血、肝细胞损害时血清结合珠蛋白显著降低。炎症、损伤、传染病、白血病、风湿病、缺血性心脏病、淋巴肉芽肿、系统性硬皮病、各种恶性肿瘤以及放射病时血清结合珠蛋白水平明显升高。本结果显示胰腺癌患者血清结合珠蛋白含量明显升高,其在胰腺癌发生中的作用还有待于进一步地研究。
转甲状腺素蛋白又称维生素A运转蛋白,相对分子量为54 000,由4个相同的亚单位组成[8]。转甲状腺素蛋白主要由肝细胞合成。早在1984年就发现,当转甲状腺素蛋白基因发生突变时,机体心肌及神经系统可发生广泛淀粉样病变[9]。肝实质受损伤的急、慢性肝炎患者血清中转甲状腺素蛋白含量明显降低,原发性肝癌患者血清中转甲状腺素蛋白含量也明显下降。转甲状腺素蛋白在胰腺和肝脏的胚胎发生过程中具有重要作用[10]。本组胰腺癌患者血清中转甲状腺素蛋白明显升高,与胰腺癌的相关性也需要进一步的大样本的比对研究。
KIAA类基因是一类从脑组织cDNA文库中获得的编码大分子蛋白的功能未知的基因,KIAA1018在不同组织、细胞中的表达不同,功能各异,有的参与了蛋白质与蛋白质的相互作用[11-13]。 Lee等[14]报道,在耐药的卵巢癌细胞株中,KIAA表达增强;在低分化的膀胱癌细胞株中,KIAA基因表达也增强。Sugita等[15]报道,KIAA在神经上皮肿瘤中高表达。KIAA家族成员众多, 本结果显示,KIAA1018在胰腺癌患者血清中含量很高,而正常人血清中未检测到。通过对其功能以及其他消化道肿瘤患者血清中KIAA1018含量的检测,我们认为其有望成为胰腺癌高危人群筛选和早期诊断的肿瘤标记物,我们将作深入研究。
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2010-01-25)
(本文编辑:屠振兴)
Differentialexpressionofserumproteinsofpancreaticcancerpatients
LIXing-hua,FANGDe-ning,SHENYi,CENGChai-ming,DENGShu-juan.
DepartmentofGastroenterology,ShanghaiEighthPeople′sHospital,Shanghai200235,China
LIXing-hua,Email:lixinghua2002@yahoo.com.cn
ObjectiveSerologic proteome analysis method (SERPA) was used to compare the different of the serum proteins between normal and pancreatic cancer patients′ serum, and to find a new specific pancreatic cancer marker.MethodsHPLC was used to eliminate albumin from the serum, two-dimensional electrophoresis was used to separate the proteins. After imaging collection and analysis, the different proteins between pancreatic cancer and normal subjects were cut for mass spectrometry.ResultsFour discrepancy proteins were obtained. Guanylate cyclase-activating protein 2 was highly expressed in normal serum but not pancreatic cancer. Hp2-alpha, transthyretin and KIAA1018 protein were highly expressed in cancer patients′ serum but not normal people.ConclusionsKIAA1018 may become a promising tumor marker for screening and early diagnosis of pancreatic cancer.
Pancreatic neoplasms; Proteonics; Serum proteins; Tumor markers,biological
10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.007
国家自然科学基金(30370646);上海市自然科学基金(09ZR1423800)
200235 上海,上海市第八人民医院消化内科
李兴华,Email:lixinghua2002@yahoo.com.cn