急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺代谢特征分析

汤伟 陆建平 汪剑 龚燕芳 蒋斐 王洋 马超 田冰

·论著·

急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺代谢特征分析

汤伟 陆建平 汪剑 龚燕芳 蒋斐 王洋 马超 田冰

目的对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠离体胰腺组织块行高分辨魔角旋转核磁共振波谱分析(HR-MASNMR)，探索其代谢变化特征。方法按完全随机法将30只Wistar大鼠分为ANP组(20只)和对照组(10只)。ANP组大鼠经腹腔分2次注射L-精氨酸2.5 mg/g体重方法制备，对照组仅注射等容积的生理盐水。运用HR-MASNMR分析两组离体胰腺组织代谢物的含量。结果造模12 h后，胰腺水肿伴出血、实质内大片凝固性坏死、 间质中炎性细胞浸润，并见胰周脂肪皂化；血清淀粉酶水平为(3527±429)U/L，显著高于对照组的(1250±188)U/L。波谱分析显示ANP组胰腺组织的牛磺酸(Tau)、乙酸(Ace)、丙氨酸(Ala)波峰下面积较对照组显著增加(P<0.05);甜菜碱(Bet)、磷酸胆碱+甘油磷酸胆碱(Pc+Gpc)含量较对照组降低(P<0.05)；胆碱(Cho)、谷氨酸(Glu)、乳酸(Lac)波峰下面积与对照组无明显差异。结论ANP大鼠离体胰腺组织块具有显著的代谢特征，为进一步开展人类重症急性胰腺炎在体波谱研究奠定了实验基础。

胰腺炎，急性坏死性； 磁共振波谱学； 代谢； 精氨酸

磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy，MRS) 分析是用来检测活体内组织代谢与生化指标的无创性技术。在疾病早期，传统影像学检查未见异常时波谱检查往往能探测出病理反应引起的异常代谢改变[1]。本文采用高场磁共振仪对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠离体胰腺组织块进行1H MRS分析，检测代谢物相对含量的改变，以期指导下一步临床开展在体波谱代谢研究工作。

材料和方法

一、实验动物及分组

清洁级雄性Wistar大鼠30只，体重200～220 g，由第二军医大学动物实验中心提供。Wistar大鼠按完全随机法分为对照组(10只)及急性坏死性胰腺炎(ANP)组(20只)。ANP组注射20%L-精氨酸溶液2.5 mg/g体重，间隔1 h，重复注射一次。对照组注射等容积生理盐水。造模后12 h处死各组大鼠，获取血液、胰腺及肝脏标本。

二、血清淀粉酶检测

经Hitachi 7600-120全自动生化分析仪测定。

三、胰腺组织病理学检查

常规行胰腺组织病理学检查。光镜下观察胰腺组织学改变，并参照Czakó等[2]标准从胰腺水肿、出血、坏死、炎细胞浸润等4个方面进行评分。

四、1H MRS分析

取保存于液氮的对照组及ANP组胰腺组织各8份，经重水淋洗后，取15 mg样品装入4 mm的附带球形内腔的ZrO2转子，在BRUKER AVANCE-600谱仪上进行分析。1H共振频率为600.13 MHz。测试用探头为高分辨魔角旋转头( High-resolution Magic Angle Spinning，HR-MAS),魔角转速5 kHz，测试温度300.0 K。谱图采样点数65 K，谱宽20 ppm，驰豫延迟2 s，累加次数256次，以3.17 ppm胆碱峰定标，均采用预饱和法压制水峰，并利用CPMG自旋回波压制大分子及其他一些短T2物质的信号。一维1H谱是由预饱和与CPMG两种实验方法获得，CPMG脉冲序列总的自旋回波时间是180 ms。同时，二维J分解实验、异核单量子相关谱、TOCSY总相关谱、COSY相关谱用来确认1H谱的谱峰指认。由CPMG测得的压制掉大分子物质的一维1H谱数据用于主成分分析，得到PC1和PC2的得分图和负载图。利用Bruker公司的Topspin 2.1软件程序对数据进行相位基线校正，并利用Topspin 2.1软件对图谱进行降维简化处理，同时利用AMIX打包软件对简化后的数据进行PCA处理，得到相应的得分图和负载图。所得谱图采用机器自带软件分析，计算不同化合物波峰下面积。

五、统计学处理

结 果

一、血清淀粉酶水平变化

ANP组血淀粉酶水平为(3527±429)U/L，显著高于对照组的(1250±188)U/L(P<0.05)。

二、胰腺病理形态学改变

对照组胰腺无明显病理改变。ANP组在注射精氨酸1 h后死亡2只，其余大鼠有少量浑浊腹水，大体胰腺组织充血、水肿、出血，并可见黄白色钙皂斑；光镜下见腺泡结构明显破坏，大片坏死组织，胰腺实质内可见红细胞，间质中见大量炎性细胞浸润(图1)。

图1 对照组(a)和ANP组(b)胰腺病理改变(HE ×200)

三、胰腺组织代谢产物主成分分析及定量测定

对照组及ANP组胰腺组织样品的HR-MAS1HMRS谱图见图2。正常和ANP胰腺样品处于得分图的不同区域(图3a)。负载图(图3b)显示将正常胰腺、ANP胰腺组织分开的主要代谢产物有：牛磺酸(Tau)3.45～3.35 ppm、甜菜碱(Bet)3.25～3.20 ppm、磷酸胆碱+甘油磷酸胆碱(Pc+Gpc)3.20～3.18 ppm、乙酸(Ace)1.93～1.80 ppm、丙氨酸(Ala)1.51～1.40 ppm，不能分开的代谢产物有胆碱(Cho)3.18～3.13 ppm、谷氨酸(Glu)2.40～2.28 ppm、乳酸(Lac)1.33～1.22 ppm。以谱图中3.167的Cho定标，以3.895的Cre为参照，取4.70～0.70为整个积分范围，通过Bruker公司的Topspin 2.1软件测量，正常组的Cho、Pc+Gpc、Tau、Bet、Glu、Ace、Ala和Lac的波峰下面积分别为0.44±0.06、1.14±0.45、0.13±0.03、0.73±0.34、0.43±0.05、0.20±0.06、0.23±0.06和0.97±0.41；ANP组分别为0.41±0.13、0.55±0.17、0.25±0.07、0.32±0.09、0.49±0.10、0.30±0.05、0.40±0.10和1.03±0.50。ANP组胰腺组织的Tau、Ace、Ala的波峰下面积较正常组增加(P<0.05);Bet、Pc+Gpc的波峰下面积较正常组减小(P<0.05)； Cho、Glu、Lac的波峰下面积与正常组无明显差异。

图2 正常(a)和ANP(b)离体胰腺组织块的1HMRS谱图

图3 由NMR CPMG 1H谱得到的得分图(a)和负载图(b)

讨 论

临床诊断ANP常用的方法包括血清淀粉酶检查及传统的影像学形态检查，这些方法虽具有较高的特异性和敏感性[3-4]，但在极早期的ANP诊断上仍存在一定局限性。

随着磁共振波谱技术(MRS)的发展，高场强的MRI-MRS一体化仪器的问世和MRS灵敏度的不断提高，MRS在临床诊断中得到了广泛地应用[5-6]。由于胰腺解剖位置深在，加上目前临床上使用的MR机器场强较低(1.5～3.0T),所得到的谱图分辨率较低，因此，MRS在胰腺疾病上的应用目前还停留在动物实验上。离体动物胰腺组织可以避免在体检查时的呼吸伪影干扰，分析条件易于统一控制。本文所采用的HR-MAS的NMR具有直接将胰腺组织置于转子内，避免了样品复杂处理所导致的实验误差；因转子体积很小、内部为球形，样品可以100%地保持在检测线圈内；可将样品磁化率不均匀性降低到最低等优点，从而获得分辨率高、重复性好的图谱[7]。

本实验结果显示，ANP组胰腺组织的Tau、Ace、Ala含量增加，Bet、Pc+Gpc的含量减少，Cho、Glu、Lac的含量无变化。体内Tau能明显促进神经系统的生长发育和细胞增殖分化、减轻肝脏脂质过氧化损伤并能稳定膜结构、调节细胞渗透压、调节钙稳定，故ANP大鼠应答性地增加Tau合成，因而含量高于正常组。Ace含量升高，说明ANP时脂肪分解活跃。Gpc和Pc是细胞膜的磷脂代谢重要组分，参与细胞膜的降解与合成，是维持细胞稳定结构的重要组成部分。ANP时因胰腺腺泡坏死严重，正常细胞膜合成和分解减少，因此它们的含量降低。Bet是一种季铵型水溶性生物碱，可作为甲基供体，具有促进动物蛋白质和脂肪代谢、缓和应激、调节渗透压、增进食欲、稳定维生素等作用。人体中Bet主要是从食物中获取，另外是体内Cho转化而来。ANP时大鼠不能从食物中获取Bet，而大量腺泡细胞坏死，细胞膜生成的Cho降低，导致Bet水平亦随之减低。

[1] Smith ICP,Stewart LC.Magnetic resonance spectroscopy in medicine:clinical impact.Prg Nucl Magn Reson Spectrose,2002，40: 1-34.

[2] Czakó L，Takács T，Varga IS， et al. The pathogenesis of L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis: In?ammatory mediators and endogenous cholecystokinin. J Physiol Paris，2000,94:43-50.

[3] 何国坚，张韶斌，罗莞超，等.尿胰蛋白酶原-2、血脂肪酶、血淀粉酶在急性胰腺炎早期诊断中的应用比较.国际医药卫生导报，2005，12：106-107.

[4] Kim DH,Pickhardt PJ.Radiologic assessment of acute and chronic pancreatitis.Surg Clin North Am，2007，87：1341-1358.

[5] Yue Q,Isobe T,Shibata Y,et al.New observations concerning the interpretation of magnetic resonance spectroscopy of meningioma.Eur Radiol,2008,18:2901-2911.

[6] 田军,陆建平,汪剑,等.三维氢质子磁共振波谱成像对前列腺良性增生和前列腺癌的鉴别价值.中国医学计算机成像杂志,2004,10:105-108.

[7] van Asten JJ,Cuijpers V,Hulsbergen-van de kaa C,et al. High resolution magic angle spinning NMR spectroscopy for metabolic assessment of cancer presence and Gleason score in human prostate needle biopsies.MAGMA,2008,21:435-442.

2010-04-12)

(本文编辑：吕芳萍)

Metabolitefeaturesofacutenecrotizingpancreatitisinrats

TANGWei,LUJian-ping,WANGJian,GONGYan-fang,JIANGFei,WANGYang,MAChao,TIANBing.

DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LUJian-ping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

ObjectiveTo investigate the metabolite features of acute necrotizing pancreatitis in rats in vitro by high resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MASNMR).MethodsA total of 30 Wistar rats were randomized into ANP group (n=20) and control group (n=10). All the rats in ANP group were injected with L-arginine 2.5mg/g body weight twice, and the animals in the control group

same dose of saline. HR MASNMR was used to study the metabolic changes of acute necrotizing pancreatitis in rats in vitro.Results12 hours after the ANP induction, the pancreas were more swelling, presented with bleeding points, with mild increase in liquefied change, coagulation necrosis could be found in parenchyma and a large number of fatty tissues could be seen around the pancreas. Serum amylase level was (3527±429) U/L, which was significantly higher than (1250±188)U/L in control group. Compared with those in the control group, the signal intensity of taurine (Tau), acetic acid (Ace), alanine (Ala) of the ANP group were significantly increased. While the signal intensities of phosphocholine (Pc), glycerophosphocholine (GPc) and betine (Bet) were significantly decreased. The signal intensities of choline (Cho), glutamic acid (Glu), lactate (Lac) were not significantly different.ConclusionsThere were obvious metabolic features of pancreatic tissues of ANP in rats, and it is useful for the application of magnetic resonance spectroscopy in AP in vivo in human studies.

Pancreatitis, acute necrotizing； Magnetic resonance spectroscopy； Metabolism； Arginine

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.010

国家自然科学基金(30870709)

200433 上海，第二军医大学附属长海医院放射诊断科(汤伟、陆建平、汪剑、田冰)，消化科(龚燕芳、蒋斐)，病理科(王洋)；

华东师范大学光谱学与波谱学教育部重点实验室(马超)

陆建平，Email：cjr.lujianping@vip.163.com