MMP9特异性锤头状真核表达载体的构建及其对子宫内膜异位症细胞侵袭力的抑制作用*

西安交通大学医学院第二附属医院妇产科(西安 710004)

彭慧霞 尉春艳 陈和琼△ 吴 静

子宫内膜异位症(EM)是育龄妇女中常见病,发病率大约10%～15%,并有逐年升高趋势,25%～50%的不孕患者有子宫内膜异位症。最新研究表明,基质金属蛋白酶-9(MMP9)可特异性降解ECM的主要成分Ⅰ型胶原,促使异位子宫内膜细胞植入,在子宫内膜异位症发生机制中具有重要作用。核酶(Ribozyrne,RZ)是一种具有酶活性的小 RNA分子,能特异性地结合和切割靶基因的m RNA,从而抑制其表达。本研究采用核酶技术,构建了MMP9基因特异性锤头状核酶真核表达载体,并将其转染 EM基质细胞,抑制其对 EM基质细胞的增殖作用,探讨 MMP9基因特异性锤头状核酶对子宫内膜异位症的治疗作用。

材料和方法

1 材 料(1)组织标本来源:选取2008年1月至2008年5月西安交通大学医学院第二附属医院妇产科收治的子宫内膜异位症患者 20例,年龄25～35岁。所有患者术前至少 3个月无激素用药史,术后均经病理检查明确诊断。术中取患者典型的异位病灶进行原代子宫内膜异位症细胞培养。(2)主要材料和仪器:胎牛血清购自杭州四季青公司,DMEM培养基购自美国Gibco公司,MMP9蛋白抗体购自 Cell signaling公司,pcDNA3.1(+)真核表达载体、限制性核酸内切酶购自 TaKaRa公司。

2 方 法(1)设计核酶基因:在Genebank中查找 MM P9基因 mRNA序列,采用 RNA structure 4.6软件对其二级结构进行计算机模拟分析,按照锤头状核酶设计原则(Symons模型[1]),人工设计 MMP9特异性的核酶基因序列。选择MMP9基因 1200位点的GUU三联体为核酶切割位点,催化活性中心选择保守的22个核苷酸序列,在核酶基因序列两端分别加上BamH I和EcoR I酶切位点及保护碱基。设计后的核酶基因序列为:(A):5'GCGGAATTCGA

GGAACACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACT GTATCCTGGATCCCGC3';(B):5'GCGGGATCCA GGATACAGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGT GTTCCTCGAATTCCGC3'。核酶基因由Invitrogen公司合成,命名为RZ基因。(2)核酶基因真核表达载体的构建:将载体 pcDNA3.1用 BamH I和EcoR I双酶切,经质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后,回收大片段。RZ基因用 BamH I和EcoR I双酶切,经质量分数为2.6%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后,回收大片段。将pcDNA3.1和RZ基因双酶切产物加入等体积含有 T 4DNA连接酶的反应液,16℃连接 2h。将连接产物转化 DH5α大肠埃希菌,涂布于含 100 0μg/ml氨苄青霉素钠的LB平板上,筛选阳性克隆并扩增。抽提质粒并经 BamH I和EcoR I双酶切,2.6%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,命名为pcDNA3.1-RZ。(3)EM原代基质细胞的培养:手术室刮取子宫内膜标本,超净台内剪成约 1mm3后,用6ml 1.25 g/L胶原酶 IV消化 70～90 min,离心后用 D-8900重悬,用 200目和400目筛网 2次过滤后接种于75cm2flask中,2 h后换液,洗去多余的红细胞和腺上皮细胞,置于37℃、5%CO2培养箱中。(4)质粒转染及Western blot检测:将EM基质细胞分为正常对照组,转染空质粒组和转染pcDNA3.1-RZ组,具体操作按脂质体 Lipofactamine 2000说明书进行。转染稳定后用Western blot法对各组细胞内MMP9蛋白的表达进行检测。(5)细胞体外侵袭能力测定:采用 transwell小室法。在下室中加入已培养过细胞的上清作为诱导剂。上下室间置 PVPF微孔滤膜,膜上铺Matrigel基质胶,37℃放置30min。用不含胎牛血清的DMEM悬浮正常对照组、转染空质粒组和转染 pcDNA3.1-RZ组细胞,并将其加入对应的小室中,每个小室 8×104个。37℃、5%CO2的培养箱培养12h。取出小室,拭去膜表面的残留细胞,结晶紫染色30min,光学显微镜下观察侵袭至膜上的细胞,每孔计数 5个高倍镜视野(×100)中的细胞数总和,求其平均值。以穿膜细胞数目的多少作为评价细胞侵袭能力强弱的指标。(6)统计学方法:采用t检验。

结 果

1 质粒鉴定 运用BamHI和EcoRI双酶切,质量分数为2.6%的琼脂糖凝胶电泳30min,可见插入的目的片段约 46bp,与预期一致(见图1)。

图1 核酶基因真核表达载体的鉴定

2 Western blot检测 转染pcDNA3.1-RZ的EM基质细胞中 MMP9蛋白的表达显著低于正常对照组和转染空质粒组(见图2)。

3 细胞体外侵袭力 转染pcDNA3.1-RZ组细胞穿过人工膜细胞数为25.2±3.4,明显低于正常空白组、转染空质粒组的59.3±4.3和58.6±3.8(P均＜0.05)。

图2 Westen blot检测MMP9蛋白的表达

讨 论

子宫内膜异位症虽然是一种良性病变,但是异位子宫内膜具有对卵巢等盆腔器官和腹膜的黏连、侵袭和转移等类似肿瘤的生物学行为[2]。近来的研究发现,EM的内膜可能通过细胞外基质的作用使异位内膜更易于种植和侵袭腹膜及周围组织。基质金属蛋白酶(MMPs)是锌依赖性的蛋白酶家族,其家族成员可以降解所有细胞外基质成份,破坏基底膜,排除细胞种植屏障。MMP9是MMPs家族中分子量最大的明胶酶,能降解细胞外基质中Ⅳ型、V型胶原和明胶这三种主要成份;并能促进血管内皮细胞的出芽,导致新生血管的形成;同时可通过与整合素的相互活化而加强细胞间的黏附作用,从而在子宫内膜细胞的异位黏附、种植和生长的过程中发挥重要作用[3,4]。目前研究也证明MM P9蛋白在 EM在位内膜的表达显著高于正常子宫内膜[5]。因此我们推测,如果能抑制 MMP9蛋白的表达,可能能有效抑制子宫内膜异位细胞的生长和增殖。核酶是具有酶催化活性的小分子核酸(RNA)。它不仅可以像反义 RNA那样与mRNA结合,阻断其转录、剪切加工和翻译复合体形成等环节,还能在m RNA中的特异位点将其切割,使其失去生物学功能。锤头状核酶由于结构简单、易于设计、合成及转移而受到人们广泛关注。锤头状核酶由22nt的催化活性中心及2个互补的侧翼序列构成,可特异性识别并切割 GUX三联体(X:C、A、U)。但是,由于靶 RNA存在复杂的二级结构,并非所有的GUX三联体都是理想的切割位点。因此,选择合适的切割位点是充分发挥核酶切割效率的关键。选择理想的靶位点需要考虑:①靶位点所在的序列具有重要的生物学功能;②选择的位点及其周围序列具有高度保守性;③三联体应位于一个环状结构上,有利于核酶接近底物;④具有高比例的A+U,有利于核酶与底物之间的退火,有利于提高核酶的催化周转率[6]。本实验应用计算机辅助法分析MM P9 mRN A的二级结构,依据以上原则选择第1200位的GUU三联体作为核酶的切割位点,设计并合成核酶基因,将其插入到 pcDNA3.1中,成功构建了针对MM P9基因的特异性锤头状核酶真核表达载体(pcDNA3.1-RZ)。我们将 pcDNA3.1-RZ转染 EM基质细胞后发现,重组质粒可明显抑制 EM基质细胞中MM P9蛋白的表达,Boyden小室法显示转染pcDNA3.1-RZ组的EM基质细胞的侵袭力明显减弱,与转染空质粒组和正常空白组相比具有统计学意义(P＜0.05)。因此,我们设计的pcDNA3.1-RZ重组质粒可有效切割 EM基质细胞内MMP9 mRNA,进而抑制 MMP9蛋白的表达,使其失去生物学活性,从而抑制异位子宫内膜细胞的侵袭性生长,为进一步的研究提供了细胞学基础,为子宫内膜异位症的治疗提供了新的思路。

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