响应面法优化野生毛葡萄中原花青素醇提工艺的试验

涂 佳， 邓学良， 李忠海， 薛敏敏

(中南林业科技大学食品科学与工程学院， 湖南 长沙 410004)

响应面法优化野生毛葡萄中原花青素醇提工艺的试验

涂 佳， 邓学良， 李忠海， 薛敏敏

(中南林业科技大学食品科学与工程学院， 湖南 长沙 410004)

依据响应面试验设计法，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、反应温度(C)为考察因素，对野生毛葡萄籽中原花青素醇提工艺进行优化试验。经对各因素的显著性和交互作用的分析，得出野生毛葡萄籽中原花青素醇提的最佳工艺条件为： 乙醇浓度为64%、料液比为1∶7、提取温度为35℃。建立的原花青素醇提数学模型为：Y=0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2，原花青素得率的预测值为86.95mg·g-1、验证值为85.54mg·g-1。证明此模型是合理可靠的，可用于实际预测。

野生毛葡萄籽； 原花青素； 醇提； 响应面法； 优化

野生毛葡萄(VitisquinquangularisRehd.)是葡萄科(Vitaceae)葡萄属(VitisL)真葡萄亚属(E-uvitis)东亚种群中的一个种,是我国葡萄属东亚种群中分布最广的一个野生种,生长在山区林缘和灌木丛中,主要分布于秦岭、泰山以南17个省份的广大地区。野生葡萄分布范围广，资源储量大，因而促进湖南地区的野生葡萄资源开发利用与产业化生产有重要意义。原花青素(Proanthocynadiin，简称PC)是存在于葡萄中的一种天然植物多酚[1],在葡萄皮、籽中含量很丰富。目前已报道的不同原料中原花青素的提取方法主要有溶剂法及仪器辅助提取法。本试验采用溶剂提取法，常用的提取溶剂包括热水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯及其水溶液等。考虑到食用安全性，本试验用乙醇作为提取溶剂，并采用响应面分析法对影响原花青素醇提的关键因素进行优化，以期为科学利用野生毛葡萄籽中的原花青素提供参考。

1 仪器及材料

1.1主要仪器

紫外可见分光光度计(UV — 1700)，日本岛津公司；操作软件(UV — PROBE)，日本岛津公司；旋转蒸发仪(R201D — Ⅱ)，郑州长城科工贸有限公司；真空冷冻干燥仪 (FD — IA)，北京博医康实验仪器有限公司。

1.2主要试剂及配置

原花青素(含量>95%)，天津尖峰天然产物研究开发有限公司；乙醇，国产工业级，其它试剂为分析纯。

2 试验方法

2.1样品处理

将完整野生毛葡萄鲜果洗净，手工剥皮，取籽。毛葡萄籽洗净晾干后研磨，过40目筛，立即置入30℃石油醚中脱脂8h，晾干，冷冻保存备用；毛葡萄皮经真空冷冻干燥后研磨，立即置入30℃石油醚中脱脂8h，晾干，冷冻保存备用。

2.2原花青素测定原理

原花青素和儿茶素类单体的A环的化学活性较高,在酸性条件下,其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩和,产物在浓酸作用下形成红色的正碳离子,样品的浓度与产生的颜色呈正相关, 500nm波长下测定其吸收光值[2]。利用紫外可见分光光度计在较大稳定吸收波长处测定吸光值，对照原花青素曲线，测得原花青素的含量。

2.3检测条件及波长的确定

将制备好的原花青素提取液0.5mL与2.5mL 30g·L-1香草醛和2.5mL 30%硫酸于30℃避光反应15min后，利用紫外可见分光光度计在200～800nm波长范围内扫描，确定测定原花青素的检测波长。原花青素与香草醛的酚醛缩合反应生成的红色物质在500nm波长处有最大吸收，据此，试验中采用分光光度法于在500nm处测定原花青素含量[3]。

2.4原花青素标准曲线的绘制

准确称量预先烘干的原花青素0.05g，用甲醇溶解，并用甲醇定溶至50mL，得到浓度为 1g·L-1的原花青素标准溶液。将上述标准溶液分别配制成浓度为 0.01mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.3mg·mL-1、0.35mg·mL-1、0.4mg·mL-1的原花青素标准溶液。于试管中依次加入0.5mL不同浓度的标准水溶液、2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混匀后于30℃水浴保温20min后测定A500nm，绘制原花青素的标准曲线。根据标准溶液的吸光值，可以求出原花青素浓度与其吸光值的数学关系。用spss软件进行数据处理，所得到的回归方程为A=2.08C-0.016(C:浓度mg·mL-1；A:吸光值；相关系数:r=0.998)。结果表明原花青素含量在0.010～0.400mg·mL-1范围内与吸光值线性关系良好。

2.5原花青素提取工艺优化

2.5.1 原花青素提取单因素试验

(1) 最佳提取剂的选择。称取1g 40目脱脂葡萄籽，按1∶7的料液比，在50%、70%、90%的乙醇中于40℃提取40min(2次)后离心过滤，用相对应的浸提剂定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混匀后于30℃水浴保温20min后，利用紫外可见光分光光度计在500nm处测其吸光度。

(2) 料液比对原花青素提取效果的影响。称取1g 40目脱脂葡萄籽，按料液比为1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9的比例加入70%乙醇浸提剂于40℃提取40min(2次)后离心过滤，用相对应的浸提剂定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混匀后于30℃水浴保温20min后，利用紫外可见光分光光度计在500nm处测其吸光度。

(3)温度对原花青素提取效果的影响。称取1g 40目脱脂葡萄籽，按1∶7的料液比加入70%乙醇浸提剂，分别于20℃、30℃、40℃、50℃提取40min(2次)后离心过滤，用相对应的浸提剂定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混匀后于30℃水浴保温20min后，利用紫外可见光分光光度计在500nm处测其吸光度。

(4)提取时间对原花青素提取效果的影响。称取1g 40目脱脂葡萄籽，按1∶7的料液比加入70%乙醇浸提剂，于40℃分别提取20min、40min、60min、80min(2次)后离心过滤，用相对应的浸提剂定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混匀后于30℃水浴保温20min,后利用紫外可见光分光光度计在500nm处测其吸光度。

2.5.2 原花青素提取率的计算

2.5.3 响应面优化原花青素提取方法 在单因素试验的基础上，筛选出影响原花青素提取效果的因素：溶液浓度、料液比、反应温度。以不同提取浓度A、不同料液比B和不同的提取温度C3因素3水平，以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-X0)X0/ΔX对自变量进行编码，共设立了20个处理组。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长，因子编码及水平见表1，响应设计见表2。

表1 原花青素提取因素水平表水平(xi)浸提液浓度(A)(%)料液比(B)(固∶液)提取温度(C)(℃)1501∶6302701∶7403901∶850注:x1=(A-70)/20;x2=(B-6)/2;x3=(C-40)/10

2.5.4 葡萄皮原花青素与葡萄籽原花青素的比较 利用葡萄籽最优提取条件，提取葡萄皮中原花青素，比较两者原花青素含量。

3 结果与分析

3.1乙醇浓度对原花青素提取效果的影响

从图1可以看出，在70%乙醇中原花青素提取率最高。

图1 乙醇浓度对原花青素提取率的影响

3.2料液比对原花青素提取效果的影响

以70%乙醇为提取剂。不同的料液比对原花青素提取效果的影响见图2。提取效果随料液比增大而增大，当料液比达到一定程度时，再增大料液比提取效果基本稳定，但若料液比增大到一定值后再继续增大，提取率反而降低。说明适宜的料液比能达到最好的提取效果，这时有效成分基本溶出，没必要再增大料液比。由图2可知，最适料液比为1∶7。

图2 不同料液比对原花青素提取率的影响

3.3提取温度对原花青素提取效果的影响

不同的提取温度对原花青素提取效果的影响见图3。由图3可知，提取温度在20～50℃之间时，提取物中原花青素含量随温度的增加而迅速增加，在50℃时开始下降。当温度大于50℃时，提取物中原花青素会分解。因此，为了尽量减小有用成分的损失，提高产品活性成分的含量，降低生产成本，宜选择提取温度为40℃较适合。

图3 不同提取温度对原花青素提取率的影响

3.4提取时间对原花青素提取效果的影响

不同提取时间对原花青素提取效果的影响见图4。由图4可知，提取时间在40min内，提取物中原花青素的含量随时间的延长明显增加，但40min之后，原花青素含量不再增加。这可能是由于在一定范围内，提取时间越长，提取液与被提取物质相互作用的时间越长，因而提取率就越高，但当两者达到平衡后，提取率将不再增加，如果再延长提取时间其它杂质也可能被提取出来，从而可能使产品的有效成分含量相对减少，因此提取时间应控制在40min左右。

图4 不同提取时间对原花青素提取率的影响

3.5响应面优化法提取原花青素

3.5.1 响应面法优化原花青素提取条件 以乙醇浓度、料液比、反应温度为自变量。根据单因素试验结果并综合考虑生产工艺易行性，固定提取温度为40℃，用响应面法，以紫外吸光度值为响应值(因变量Y)，对乙醇浓度(A)、料液比(B)和反应温度(C)3因素的3水平进行原花青素提取条件优化,试验设计及结果见表2。

如表2所示，试验点共有20个。可分为2类：即14个析因点和零点，零点为区域的中心点。零点试验重复6次，以估计误差。按照Design Expert软件中的Central Composite Design模型，对试验获得的原花青素得率响应值进行回归，建立二次回归模型。初步回归方程为：

Y= 0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-

0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2

3.5.2 回归分析 利用Design Expert7.1 软件进行二次多元回归拟合，由软件失拟项测试推荐的二次模型拟合试验数据，采用二次模型进行变异分析(Analysis of variance，ANOVA)。表3中，模型P项<0.0001，表明吸光度值高度显著；相关系数R2为0.9978，表明模型拟合度较好；离散系数为2.85，表明模型的精度高，适用性好；A、B、C、AB、BC、AC、A2、B2、C2的P值均在0.05 以下，说明乙醇浓度、料液比、反应温度的交互作用对吸光度值有显著影响。模型的P失拟为0.1565 不显著，说明模型可靠，可以用于原花青素的测定。依据系数估计值A=-0.058、B=0.029、C=-0.12可知，因素的主次效应关系为乙醇浓度>料液比>浸提温度。

表2 响应面法设计试验组号浸提液浓度(A)(%)料液比(B)(固∶液)提取温度(C)(℃)吸光度值x1x2x31-1-1-10.4321-1-10.233-11-10.48411-10.355-1-110.1561-110.087-1110.1881110.129-1000.57101000.45110-100.48120100.531300-10.56140010.3150000.619160000.613170000.605180000.62190000.597200000.43

在α=0.05显著水平下剔除不显著项后，对方程进行优化可得：

Y= 0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-

0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2

根据回归分析结果，作出模型响应面和等高线图，如图5～7所示。

由图5可以看出，在料液比较少时，随着乙醇浓度的增大，原花青素提取率先增大到浓度70%后逐渐减小；料液比增加后，当乙醇浓度增大到70%左右时，总提取率达到最大，再增大乙醇浓度，提取率反而下降，这与单因素试验结果相符。从图6可以看出，在提取温度较低时，随着乙醇浓度的增大，原花青素提取率先增大后减小；温度增高后，当乙醇浓度增大到62%～65%时，总提取率达到最大，再增大乙醇浓度，提取率反而下降，这与单因素试验结果相符，分析原因可能是在高温高浓度乙醇条件下，葡萄液中一些醇溶性杂质溶解量增大，这些物质与原花青素竞争同乙醇 — 水分子的结合，从而导致原花青素提取率降低。从图7可以看出，在反应温度低时，提取率随着料液比先增加后减少；但当反应温度达到一定程度时(40℃左右时)料液比在1∶7左右提取效果最好，再增大料液比提取效果反而下降。

表3 模型与方差分析来源平方和自由度均方F值P-值显著性模型0.6710.075498.86<0.0001显著A—浸提液浓度0.03410.034224.76<0.0001B—料液比8.410E—0.0318.410E—00356.19<0.0001C—温度0.1510.15994.45<0.0001AB8.000E—00418.000E—0045.530.0434AC5.000E—00315.000E—00333.410.0002BC1.250E—00311.25E—0038.350.0161A20.02310.023150.49<0.0001B20.02510.025167.57<0.0001C20.0810.080534.13<0.0001残差1.497E—0.03101.498E—004失拟项1.084E—00352.168E—0042.630.1565不显著纯误差4.128E—00453.577E—003 复相关系数R2=0.9978离散系数为2.85

图5 乙醇浓度和料液比对原花青素提取的影响

图6 乙醇浓度和反应温度对原花青素提取的影响图

图7 料液比和反应温度对原花青素提取的影响

进一步用Design Expert软件对试验模型进行典型性分析，以获得最优的提取条件。经分析得，在A=64、B=7、C=35，即在乙醇浓度为64%、料液比为1∶7、提取温度为35℃时得到理论最大值(A500nm)为0.641。

3.5.3 验证试验 为了验证响应面法的可行性，采用得到的最佳提取条件进行野生毛葡萄籽原花青素提取试验，乙醇浓度64%、料液比1∶7、温度35℃。3次平行试验得到的实际平均值(A500nm)为0.631，与方程模拟值相吻合。在此条件下，野生毛葡萄籽原花青素的提取率为85.54mg·g-1。因此响应面法对野生毛葡萄籽原花青素提取条件的优化是可行的，得到的野生毛葡萄籽原花青素提取条件具有实际应用价值。

4 结论与讨论

本研究先对野生毛葡萄籽进行提取预处理，以野生毛葡萄籽提取液吸光度A500nm为量化指标，在单因素试验的基础上将响应面法应用到野生毛葡萄籽原花青素的提取。结果表明乙醇浓度、料液比和提取温度对原花青素提取率的影响显著，且不是简单的线形关系。通过回归分析和验证试验结果表明，此方法是合理可行的。得到原花青素最佳的提取条件为乙醇浓度64%、料液比1∶7、提取温度35℃，最终试验值与理论预测值很接近，在此条件下，野生毛葡萄籽原花青素提取量为85.54mg·g-1，提取率为8.55%。

传统的数理统计方法一般采用正交设计,可同时考虑多种因素,寻求最佳因素组合,但不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式,从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。响应面分析方法是通过中心组合试验研究几种试验因素间交互作用的一种回归分析方法,具有试验次数少、周期短,求得的回归方程精度高等优点,随着计算机技术的发展,这种方法已经成为精度高、应用广，并具有实用价值的技术。由试验结果可知，响应面优化的提取率为8.55%，高于各个单因素法提取率。因此可以考虑采用响应面优化法得到理论上的提取最高值。

[1] 国植，徐莉.原花青素：具有广阔发展前景的植物药[J].国外医药：植物药分册，1996(5):196-203.

[2] Mitsunaga T,Doi T,Kondo Y,et al.Color development of proantho-cyanidins in vanillin hydrochloric acid reaction[J].J.Wood Sci.,1998(44):125-130.

[3] 孙芸,谷文英.硫酸 — 香草醛法测定葡萄籽原花青素含量[J].食品与发酵工业,2003,29(9):44-46.

(责任编辑：唐效蓉)

(英文编译：张 珉)

OptimizationforethanolextractionofproanthocyanidinsfromVitisquinquangularisusingresponsesurfacemethod

TU Jia, DENG Xueliang, LI Zhonghai, XUE Minmin

(College of Food Science & Project Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

The ethanol extraction technology of proanthocyanidins from seeds ofVitisquinquangulariswas studied using response surface method, and ethanol concentration(A)，solid-liquid ratio(B) and temperature(C) were selected as experimental factors. Based on analysis of significance and interaction among different factors, the optimum condition of ethanol extraction technology was obtained as followed: ethanol concentration was 64%，solid-liquid ratio was 1∶7 and temperature was 35℃。The mathematical model of proanthocyanidins extraction wasY=0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2. And the predicted value and measured value of proanthocyanidins yield were 86.95mg·g-1and 85.54mg·g-1, respectively. So the obtained model is credible and could be used for actual prediction.

seeds ofVitisquinquangularis; proanthocyanidins; ethanol extraction; response surface method; optimization

2009 — 12 — 15

2010 — 01 — 26

R 284.2

A

1003 — 5710(2010)01 — 0001 — 06