石河子地区动物性食品中单核细胞增生李斯特菌的检测

孟庆玲，张再超，乔 军

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003）

单核细胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes，LM）是一种能引起人和动物李氏杆菌病的人兽共患病原菌[1]。作为一种重要的食源性细菌，该菌能污染肉、奶、蛋等动物性食品而引起食品中毒，导致孕妇、新生儿及免疫力低下的成年人发病，对人们的身体健康构成了严重的威胁，被列为四大食源性病原菌之一[2-3]。病原学调查发现，在我国很多城市动物性食品中都存在LM的污染，动物性食品已经成为人感染LM的主要传播媒介。为了解新疆石河子地区动物性中单核细胞增生李斯特氏菌污染状况，我们对石河子地区5个具有代表性动物性食品零售点的8类动物性食品进行病原的分离培养和PCR检测。

1 材料与方法

1.1 动物性食品检测样品的采集

选择石河子5个具有代表性的动物性食品零售点，于2009年10—12月随机采集生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、冻鸡肉、冻虾和冻带鱼8类动物性食品共249份。

1.2 主要试剂

细菌分离鉴定试剂：LB1、LB2增菌液、TSA-YE、SIM动力培养基、TSI和其他鉴定用的生化培养基均购自上海生物工程有限公司。生化鉴定试条API Listeria购自法国生物梅里埃公司。PCR检测用试剂：Taq plus DNA聚合酶、dNTPs和细菌DNA 提取试剂盒均购自上海生物工程公司。

1.3 细菌的分离培养及鉴定

细菌的分离培养和鉴定参照GB4789.30-2003进行。以无菌操作将25 g样品加入到225 mL LB1增菌液中，30℃培养24 h。取0.1 mL加入到10 mL LB2增菌液中30℃培养24 h。无菌取LB2增菌液转种到CHRO Magar李斯特菌显色培养基琼脂平板上，35℃培养24 h。菌落特征为中心绿色，周围带白色晕圈。可疑菌落同时接种于SIM和TSI培养基中，SIM培养基25℃培养5 d，TSI培养基37℃培养24 h。LM动力呈伞状或月牙状生长，产酸不产气。将以上可疑菌落接种于TSA-YE琼脂培养基中，37℃24 h的纯培养。

将TSA-YE培养基内的单个菌落做革兰氏染色镜检，做氧化酶、触酶试验，并接种鼠李糖、木糖、甘露醇、七叶苷，同时点种血平板观察溶血情况，用标准菌株作对照，凡染色镜检和生化与LM相吻合者，再用API Listeria鉴定试剂条进行鉴定。

1.4 PCR检测

根据GenBank中已发表的LM PrfA蛋白基因序列，选择高度保守区域设计了特异的引物P1和P2，上游引物 P1：5'-GCTCACGAGTATTAGC GAGA-3'；下游引物 P2：5'-GATAA TCAAGATTTTGTACA-3'。扩增预期长度为475 bp。用SDS-蛋白酶K法提取样品DNA。取提取的DNA为模板 2μL，10×PCR buffer5μL、引物P1（25 pmol/μL）、P2（25 pmol/μL）各 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs各 4 μL，水36.7μL，Taq DNA聚合酶0.3μL（5 U/μL）混匀。PCR 反应条件为 96℃预变性 180 s；94 ℃，40 s；56℃，35 s；72℃，45 s，35 个循环；然后72℃再延伸10 min，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。回收PCR产物，送上海生物工程公司进行测序，将测序结果与PrfA蛋白基因序列进行同源性比对。

2 结果

2.1 石河子地区8类动物性食品LM细菌学检测

8类食品中，成功分离出16株细菌，其中12株生化试验结果与标准菌株CMCC54007相一致，均为溶血反应阳性，硝酸盐还原阴性，尿素酶阴性，MR阳性，VP阳性，甘露醇阴性，鼠李糖阳性，木糖阴性，七叶苷阳性，用API-Listeria系统鉴定为阳性。LM分离培养阳性率最高为冻鸡肉和冻虾，分别为12.82%和7.14%，表明其污染最为严重；其次为生鲜鸡肉和冻带鱼，阳性率分别为5.26%和4.82%；生鲜牛肉和羊肉均未检出单核细胞增生李斯特氏菌（表1）。

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2.2 PCR检测结果

应用PCR法对8类食品249份样品进行了检测，结果检测出阳性样品36份，平均阳性率为14.46%。其中，冻虾和冻鸡肉PCR阳性率仍然最高，分别为35.71%和28.21%；其次为生鲜鸡肉和冻带鱼，阳性率分别为15.79%和 13.04%（表 1、图 1）。

3 讨论

LM属于革兰氏阳性无芽孢兼性厌氧杆菌，在酸性（pH 4.5~7.0）、碱性（pH 7.0~9.0）、高盐（10%NaCl）、低温（0~4℃）等条件下能生长繁殖。由于其对外界各种环境的抵抗力很强，并且可通过多种途径发生播散，造成多种动物性食品的污染。自从20世纪90年代以来，世界许多国家暴发了LM污染食物引起的中毒事件，美国、加拿大、法国等国家加强了对动物性食品中的LM的检测[2-3]，我国在2000年建立了全国食源性疾病检测网，开始对食品中LM污染进行了检测。Vitas等对西班牙的295份生肉制品检测单增李斯特菌的污染率为34.9%，158份生家禽制品的污染率为36.1%[4]。丹麦的Birgit等对3 629份生肉制品检出单增李斯特菌的污染率为9.6%，225份冷藏肉制品中单增李斯特菌的污染率为14.7%[9]。我国河南、江苏、山东、陕西等地对肉类的单增李斯特菌的调查显示，生肉制品的污染率为3.15%~16.68%[5-8]。在本试验中，我们检测的8类249份动物性食品，LM分离成功的阳性样品12份，平均阳性率4.82%；PCR法检测阳性样品36份，平均阳性率为14.46%，这表明石河子动物性食品中LM的污染比较普遍，尤以冻鸡肉和冻虾LM污染较重。

目前，传统的LM分离鉴定如国家标准中EB增菌法和LB增菌法，即通过微生物的分离培养、生化反应、溶血试验、协同溶血试验、动物试验等，这些试验方法虽然设备要求不高，可操作性强，但其缺点是检验周期长，一般需6~7 d。由于动物性食品需要现场检测和消费前的快速检测，而这种传统的检测方法已很难满足动物性食品的快速检测要求。随着分子生物学技术的不断发展，PCR技术等新的方法在LM快速检测研究中得到了初步应用。在本试验中，我们根据LM P60蛋白基因具有高度保守性的特点，设计了其特异性引物用于LM的PCR检测。检测结果表明，该方法具有快速、敏感和准确的特点，可以作为国家标准的辅助检测方法，适合具备一定仪器设备检测部门用于LM的快速检测。

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