双辛可宁酸法测定胎盘多肽注射液中低浓度多肽的含量

张云楚,纪 宇

(江苏省食品药品检验所,江苏 南京 210008)

胎盘多肽注射液又名升血肽注射液,多用于治疗细胞免疫功能降低或失调引起的疾病、手术后愈合、病毒性感染引起的疾病及各种原因所致的白细胞减少症,各种传染性疾病和手术创伤的愈合。该药品的质量标准收载于国家食品药品监督管理局国家药品标准(试行)WS-10001-(HD-1430)-2003中,该标准中没有含量测定,经查文献,未发现国内期刊有胎盘多肽注射液含量测定方法的报道。目前测定多肽含量的常用方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、Folin-酚法(lowry法)、双辛可宁酸(Bicinchoninic acid,BCA)法[1]等。但上述方法多数需消耗的多肽量较大,仅 BCA法和Folin-酚法适用于低浓度多肽溶液的含量测定,但在我们的研究工作中发现 Folin-酚法样品比色后吸光度值太低,测定误差较大。这也是国家标准迟迟未增订含量测定标准的原因。所以本文对BCA法测定胎盘多肽注射液中低浓度多肽含量的方法进行了研究。

1 仪器与药品

PE Lambda 35紫外可见分光光度计,美国 PE公司。

牛血清白蛋白(BSA)对照品(批号:140619-200617)、酪蛋白对照品(批号:601-200221),中国药品生物制品检定所;胎盘多肽注射液(批号:20070907,20071021,20071242),贵州黔峰生物制品有限公司;BCA(批号:14335),Fluka公司;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 BCA法

BCA法的原理是碱性条件下,蛋白将 Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物,测定其在562 nm波长处的吸光度值,并与标准曲线对比,计算待测蛋白的含量。

参考美国药典方法[2],精密量取供试品溶液2.0mL,加入Cu-BCA试液4.0mL混匀,计时,37℃水浴准确反应 30 min,以水为空白,562 nm波长处测定吸光度;以BSA为对照品,制作标准曲线。

2.1.1 测定低浓度多肽含量恰当的标准蛋白线性范围的考察 以BSA对照品作为标准蛋白质,加水制成每1mL中约含0.2mg的溶液。精密量取对照品溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,分别置具塞试管中,各加水至2.0mL,再加入Cu-BCA试液4.0mL混匀,计时,37℃水浴准确反应 30 min,放冷至室温,在562 nm的波长处测定吸光度(A)值;同时以0号管作为空白。以A为纵坐标,以对照品浓度(C)为横坐标绘制标准曲线,多次试验的结果表明:BSA浓度在19.2～115.2μg/mL范围内,与A呈良好的线性关系,r≥0.999 0。

2.1.2 标准曲线线性的重现性试验 以BSA对照品作为标准蛋白质,1周内制作 5次标准曲线,结果见表1。可见,BCA法在BSA浓度为19.2～115.2 μg/mL范围内与A线性关系好,并且重现性好。

表1 BSA浓度为19.2～115.2μg/mL范围内标准曲线方程及r值Tab.1 BSA calibration curves equation and the correlation coefficient in the range of 19.2-115.2μg/mL

2.1.3 加样回收率试验 由于BSA对照品冻干分装于安瓿中(非化学纯品),规格为19.2mg/支,无法精密称取,故取对照品 9支分别加水溶解并稀释成28.80,48.00,69.12μg/mL,每个浓度各 3份。取已知含量的样品溶液1.0mL分别加入3种浓度的对照品溶液1.0mL,混匀,作为供试品溶液。照含量测定项下方法操作,结果见表2。平均回收率为102.2%,RSD(n=9)为3.8%。

2.1.4 重复性试验 分别取同批样品 6份,照含量测定项下方法测定含量,RSD为0.6%。

2.1.5 溶液的稳定性考察 制备的对照品溶液与供试品溶液在室温放置不同时间,测定A值,结果见表3。结果表明,对照品溶液和供试品溶液随时间推移,A值缓慢增加。对照品溶液和供试品溶液A值增加程度并不完全一致,故含量测定条件应计时 37℃水浴准确反应 30 min,放冷至室温(10 min),测定。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Determination results and recovery of the BSAin samples

表3 溶液的稳定性考察Tab.3 Investigation of the stability of the solution

2.2 BCA法与Folin-酚法、双缩脲法、凯氏定氮法进行比较

分别采用氮测定法(半微量定氮法)、双缩脲法、福林酚法分别测定胎盘多肽注射液的含量。

2.2.1 采用氮测定法(半微量定氮法)[3]发现样品中的蛋白含量很低,样品如果不浓缩,直接采用上述方法测定达不到该方法的最低定量限的要求。

2.2.2 采用双缩脲法[4]分别以酪蛋白、BSA为蛋白标准品。比色过程中发现,供试品溶液比色后颜色与对照品比色后基本一致,但有混浊乳光,过滤或离心均不能解决问题,导致供试品溶液吸光度偏高,测定结果偏高,误差较大。

2.2.3 采用Folin-酚法[3]分别以酪蛋白、BSA为蛋白对照品,该方法标准曲线线性较差。直接以本品做为供试品溶液测定,样品比色后吸光度太低(仅约0.08),含量测定易受干扰物质影响,测定误差较大。

2.2.4 采用BCA法 以BSA为对照品,采用BCA试剂比色,检测波长562 nm。该法标准曲线线性较好,直接将样品作为供试品溶液;含量测定不易受干扰物质影响。供试品溶液吸光度均在0.3～0.7之间。最终确定BCA法为本品含量测定的最佳方法。

2.3 BCA法含量测定结果

采用BCA法测定了3批胎盘多肽注射液(批号:20070907,20071021,20071224)中多肽的含量,结果(以BSA计)分别为:50.0,50.4和51.1μg/mL。

3 讨 论

随着现代生物技术的飞速发展,许多生物制品及多肽类药物生产工艺中所得多肽溶液的含量低、纯化难,不易制得,但作为质量标准控制,其多肽含量必需明确且可控,故探索低浓度多肽含量的方法具有非常重要的现实意义。

本文通过考察 BCA法在19.2～115.2μg/mL范围内效能指标,探索建立 BCA法测定胎盘多肽注射液中低浓度多肽的含量的方法。结果表明,在此范围内样品溶液的吸光度适中(0.3～0.7),有良好的线性关系,精密度高,准确度好。

文献报道[5]Folin-酚法适合于低浓度蛋白质溶液中蛋白质的含量测定,但 BCA法对比 Folin-酚法在低浓度多肽含量测定中更加优越。Folin-酚法标准曲线线性较差,样品比色后吸光度太低,含量测定易受干扰物质影响,测定误差较大。而BCA法标准曲线线性较好,样品比色后吸光度适中,含量测定不易受干扰物质影响,且该方法快速(30 min内完成测定,比经典的Folin-酚法快 4倍)。由此可见,BCA法更适于低浓度多肽的含量测定。

[1]吴梧桐.生物化学[M].北京:人民卫生出版社,2005:75-76.

[2]USP[S].32ed.2008:516.

[3]中国药典[S].二部.2005:附录 43-附录 44,附录 152.

[4]白秀峰.生物药物分析[M].北京:中国医药科技出版社,2002:282.

[5]王爱军,王凤山,王友联,等.低浓度蛋白质含量测定方法的研究[J].中国生化药物杂志,2003,24(2):78-80.