巴豆生物碱诱导Hela细胞凋亡及其作用机制

许 群,方轶萍,赵小迎

(1.温州医学院,2.温州市中西医结合医院 妇产科,浙江 温州 325000)

巴豆系大戟科植物巴豆 Croton tiglium L.的种子,味辛,民间早已用巴豆治疗肿瘤。巴豆生物碱(Croton Alkaloid,CA)是巴豆的有效成分之一。CA对甲状腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤具有治疗作用[1-2],还可通过对膜系统分子动力学、膜流动性及膜蛋白、膜脂类功能等的影响,降低肿瘤细胞的恶性程度及其转移活性,进一步促使癌细胞逆转[3]。已有研究证明,巴豆煎液对人正常淋巴细胞影响轻微,而对HL-60细胞具有较强杀伤作用,对细胞毒性具有较强的选择性[4]。本文旨在研究 CA对人宫颈癌Hela细胞的作用,并初步探讨其抗肿瘤的机理。

1 材 料

人宫颈癌 Hela细胞株购自中科院上海细胞所。CA(浙江中医药大学中药化学教研室提取制备);RPMI 1640培养基(Hyclone公司);胰蛋白酶、胎牛血清(四季青公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT,Sigma公司);AnnexinV-PI凋亡检测试剂盒(Becton Dickinson公司);Caspase-8活性检测试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所);Caspase-8(Biolegend公司);RNA提取试剂盒 Trizol Reagent(华美生物工程公司);DNA Marker(北京赛百盛基因技术有限公司);RT-PCR试剂盒(Promega公司)。

引物由上海生工基因技术有限公司合成,Caspase-8引物扩增产物为426 bp,β-actin为500 bp。

2 方 法

2.1 细胞培养

常规复苏冻存的Hela细胞悬浮培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,加入双抗青霉素和链霉素(终浓度均为100 u/mL),37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内松盖培育。每两天换液一次,细胞融合达 80%～90%时,以0.25%胰蛋白酶消化、传代。

2.2 MTT法

取对数生长期的细胞以6.0×104个/mL接种于96孔培养板中,每孔 100μL,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,培养24 h后弃上清,加入含有不同浓度 CA(50,100,200μg/mL)的培养基,每一浓度设6个复孔,每板设6个复孔的空白对照,分别培养24,48 h后取板备测。将备测孔依次加入5mg/mL MTT溶液10μL,入孵箱继续培养4 h,弃上清,每孔加入二甲基亚砜 100μL,平板振荡器上振荡 8～10 min,用酶标仪测定492 nm波长处的吸光度(A)值。实验重复 3次,取平均值。抑制率(IR)=(1-A试验/A对照)×100%。

2.3 AnnexinV-PI染色检测细胞凋亡

用RPMI 1640培养液将 Hela细胞制成3×105/mL浓度接种于24孔板中,每孔加入细胞悬液1mL,每种细胞分成4组,每组设3个复孔。37℃,5%CO2培养箱内孵育 24,48 h,收集每孔细胞于小离心管中离心,用结合缓冲液洗一次,每孔细胞悬于100μL结合液中,加入FTTC-AnnexinⅤ和PI溶液各 5μL,混匀后避光室温放置15 min,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Beckman Coulter protocol软件分析。其中AnnexinV+PI-为凋亡细胞,AnnexinV+PI+为坏死细胞。

2.4 RP-PCR检测 Caspase-8mRNA的表达

在25mL培养瓶中以1×106/mL的密度接种Hela细胞,正常对照组(仅加培养基培养),设置药物剂量梯度(CA 50,100,200μg/mL),培养12 h后取出备用。用Trizol Reagnt试剂盒提取各组细胞的总 RNA,再进行反转录反应,最后将逆转录产物 cDNA进行 PCR反应。β-actin:上游引物:5′-ATGGATGATGATATCGCCGCG-3′;下游引物:5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3′。Caspase-8上游引物:5′-TCTGGAGCATCTGCTGTCTG-3′;下游 引 物:5′-CCTGCCTGGTGTCTGAAGTT-3′。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,经Gel-ProAnalyzerVersion 3.0凝胶成像系统存储图象并分析结果,以Caspase-8与βactin基因扩增产物电泳条带的吸光度比值,表示Caspase-8的相对表达水平。

2.5 统计学分析

3 结 果

3.1 MTT法

不同浓度 CA作用于人宫颈癌 Hela细胞后,对细胞的生长具有显著抑制作用。且随着药物浓度和作用时间的增加,抑制率增高,表现为时间和剂量依赖关系。不同作用时间相同浓度相比,除 CA浓度为50mg/L作用24和48 h之间,差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余实验组之间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)(表1)。

3.2 不同浓度 CA在不同时间点对Hela细胞凋亡率的影响

结果见表2及图1。CA作用后Hela细胞凋亡率与对照组比较,差异显著(P＜0.05),且呈与作用时间和浓度成正比。不同作用时间相同浓度相比差异显著(P＜0.05),不同浓度相同作用时间相比差异显著(P＜0.05)(表2)。

表1 巴豆生物碱对Hela细胞增殖的抑制作用(n=3,±s)Tab.1 The proliferation inhibition of Croton alkaloids on Hela cells(n=3,±s)

表1 巴豆生物碱对Hela细胞增殖的抑制作用(n=3,±s)Tab.1 The proliferation inhibition of Croton alkaloids on Hela cells(n=3,±s)

与对照组比较:1P＜0.05;与24 h比较:2P＜0.05;组间两两比较:3 P＜0.05Compared with control group:1 P＜0.05;Compared with 24 h:2P＜0.05;Interclass paired comparison:3 P＜0.05

?

表2 巴豆生物碱对Hela细胞凋亡率的影响(n=3,±s)Tab.2 The cell apoptosis of Croton alkaloids on Hela cells(n=3, ±s)

表2 巴豆生物碱对Hela细胞凋亡率的影响(n=3,±s)Tab.2 The cell apoptosis of Croton alkaloids on Hela cells(n=3, ±s)

与对照组比较:1 P＜0.05;与24 h比较:2P＜0.05;组间两两比较:3 P＜0.05Compared with control group:1P＜0.05;Compared with 24h:2P＜0.05;Interclass paired comparison:3 P＜0.05

?

图1 不同浓度巴豆生物碱作用48h后Hela细胞形态学观察Fig.1 Morphologic changes of Hela cells treated with Croton alkaloids

3.3 Caspase-8试剂盒检测 CA对Hela细胞Caspase-8活性的影响

结果见表3和图2。经CA作用48 h后,Hela细胞Caspase-8活性明显上调,与对照组比较差异显著,且不同浓度 CA之间两两比较差异显著(P＜0.05)。

表3 巴豆生物碱作用48 h后对Caspase-8活性的影响(n=9,±s)Tab.3 Caspase-8 activity assay before and after 48 hours Croton alkaloids treatment of Hela cells(n=9,±s)

表3 巴豆生物碱作用48 h后对Caspase-8活性的影响(n=9,±s)Tab.3 Caspase-8 activity assay before and after 48 hours Croton alkaloids treatment of Hela cells(n=9,±s)

与对照组比较:1 P＜0.05;组间两两比较:2P＜0.05Compared with control group:1P＜0.05;Interclass paired comparison:2P＜0.05

组别 剂量/(μg/mL) Caspase-8活性(A实验 /A空白)对照组 - 5.98±0.13巴豆生物碱组 50 10.67±0.311 100 12.38±0.421,2 200 13.89±0.181,2

图2 不同浓度巴豆生物碱作用24 h后对Hela细胞凋亡率的影响Fig.2 The cell apoptosis on Hela cells after 24h treatment with Croton alkaloids

3.4 RT-PCR检测 CA作用下Hela细胞Caspase-8表达的影响

Hela细胞经CA作用12 h后,采用RT-PCR方法,分析 Caspase-8mRNA基因扩增产物与β-actin基因扩增产物电泳带的吸光度比值,反映目的基因的表达水平。结果显示,经不同浓度 CA处理12 h后Caspase-8表达水平明显升高,见图3。

图3 RT-PCR检测 Caspase-8mRNA的变化Fig.3 RT-PCR analysis of caspase-8mRNA of Hela cells treated with Croton alkaloids

4 讨 论

本研究采用不同剂量的CA对人子宫颈癌 Hela细胞作用24,48 h,经MTT检测,抑制率随药物浓度和作用时间的增加而增高,并且表现为时间和剂量依赖关系。另外本研究 AnnexinV-PI流式细胞术检测发现,细胞凋亡率随时间和剂量的增加而逐渐增强,200μg/mL CA作用48 h后,细胞凋亡率达10.10%。进一步证实 CA作用后的Hela细胞出现凋亡的改变,推测 CA在体外是通过启动细胞凋亡产生抗肿瘤作用。

本研究通过 Caspase-8活性检测试剂盒和半定量 RT-PCR技术检测 CA对Hela细胞Caspase-8蛋白活性和Caspase-8mRNA表达水平的变化,进一步证实 CA通过在转录水平上调 Caspase-8mRNA的表达、激活 Caspase-8的活性而诱导细胞凋亡。但是Caspase-8通过何种途径被上调,又是通过何种信号传导途径发挥其作用的,还有待进一步研究。

[1]刘秀德,隋在云.巴豆总生物碱对癌细胞质膜流动性及胞浆基质结构的影响[J].山东中医学院学报,1995,19(3):192-194.

[2]徐立生.巴豆生物碱治疗胃癌 128例临床观察[J].中华肿瘤杂志,1992,14(5):392.

[3]徐立生,曲长芝,马志铨,等.抗癌药物巴豆生物碱、顺铂对红细胞膜的作用[J].中华肿瘤杂志,1995,17(2):115-117.

[4]徐建国,马俊英,杨贵生,等.巴豆煎液对人早幼粒细胞白血病细胞的诱导分化研究[J].中华血液学杂志,1990,11(10):538-539.