应用萌发大豆生产益生菌发酵豆乳的研究

杨 媚，李 理

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

应用萌发大豆生产益生菌发酵豆乳的研究

杨 媚，李 理*

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

通过SDS-PAGE电泳分析大豆萌发过程中大豆蛋白亚基组成含量的变化，确定以萌发至2～3cm长的大豆作为主要原料，经瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合发酵制成发酵豆乳。研究表明，与非萌发大豆制成的发酵豆乳相比，以萌发大豆制成的发酵豆乳口感和质构均得到明显改善，硬度和脆度分别下降了38.61%和38.85%，粘附性从-86.779g·s增加至-52.172g·s，口感更细腻柔软粘稠，与发酵纯牛乳相接近。

大豆萌发，大豆酸乳，发酵纯牛乳，蛋白亚基，质构特性

大豆作为世界上最重要的油料作物之一，富含蛋白质（将近40%）、不饱和脂肪酸、卵磷脂和异黄酮等营养物质［1］，近年来已被用于部分替代牛乳生产类酸奶产品［2］。然而，发酵豆乳存在豆腥味、青草味等不良风味［3］，具有产酸不足、口感不够细腻爽滑、质构粗糙硬脆不够柔软粘稠等问题，因此并未被普遍接受。大量研究表明，萌发大豆去除了抗营养因子［4］和引起豆腥味的脂肪氧化酶［5］，而增加了膳食纤维、维生素和活性异黄酮［6］等营养物质，且能产生丰富的内源蛋白酶，对大豆蛋白亚基进行一定程度的降解［7］。而大豆蛋白质结构亚基组成的改变，可以影响大豆蛋白的凝胶网络结构［8］，进而影响发酵豆乳的质构特性。国内外对发酵豆乳的研究大多通过工艺的改进来改善口感风味，但应用萌发大豆内源蛋白酶降解大豆蛋白以改善发酵豆乳的质构特性尚未见报道。本文以萌发大豆作为主要原料制作发酵豆乳，与未萌发大豆发酵酸乳对比，质构特性及口感风味均有显著改善，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆 市售；脱脂乳粉 蛋白质含量36.4%，新西兰产；精制蔗糖、NaOH等 均为分析纯；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus AS1.1482，简写为L.B 1482） 购于广东省微生物研究所菌种保藏中心；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus IFFI 6038，简写为S.T 6038） 购于广东省微生物研究所菌种保藏中心；瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus LH-B02，简写为LH-B02） Hansen样品。

JJ500型电子天平 浙江余姚铭称重校验设备有限公司；ECP3000三恒电泳仪 北京六一仪器厂；双板夹芯式垂直槽（DYCZ-30型） 广州市丛源仪器有限公司；Seven Easy pH计（S20） 瑞士；YXQSG46-280S型手提式高压灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；PXY-190S-A型生化培养箱 广东韶关科力仪器有限公司；HSG-IB-2型电热恒温水浴锅常州奥华仪器有限公司；HR 1727 PHILIPS搅拌机珠海飞利浦家用电器有限公司；TA XT2i/25质构仪 英国SMS公司；SZX超净工作台 吴江净化设备总厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆籽粒萌发 选择籽粒饱满均一、无虫蛀霉变的完整大豆籽粒，冲洗去杂后于30℃浸泡12h，在培养盆中以双层纱布铺盖萌发，30℃分别萌发至胚芽长度为0（30℃浸泡12h）、0.5、1、2、3、4、5、6、7cm。

1.2.2 SDS-PAGE分析大豆萌发过程中蛋白质亚基组分含量的变化 参照LaemmLi［9］的电泳方法。将萌发至一定长度的豆芽洗净去皮，以1∶12（w/v）豆水比打浆过滤，滤液经稀释处理后得到浓度为2.23g/mL的待测样品，于沸水中加热5min后，以10000r/min离心5min。上样量为10μL，分离胶、浓缩胶浓度分别为12.5%和3%，浓缩胶电流为40mA，分离胶电流为80mA。电泳完毕后凝胶以考马斯亮蓝R250染色40min，过夜脱色至透明后拍照。

1.2.3 发酵纯牛乳及发酵豆乳的制作

1.2.3.1 发酵豆乳制作工艺流程 大豆→挑选、浸泡→萌发→去皮→热磨浆→过滤→豆乳→加糖、牛乳→灭菌→42℃发酵4h→4℃冰箱中冷藏

1.2.3.2 发酵豆乳及复原乳的准备 取未萌发（30℃浸泡12h，即0cm）和萌发至一定长度的大豆，去皮，用85℃热水磨浆（豆水比为1∶10），过180目筛后制成豆浆备用。配制12%脱脂乳粉复原牛乳，豆浆和牛乳的比例为7∶3，制成未萌发和萌发大豆发酵豆乳，添加8%的蔗糖，100℃灭菌20min。

配制12%脱脂乳粉复原牛乳，添加8%的蔗糖，100℃灭菌20min。

1.2.3.3 母发酵剂、工作发酵剂的制备 配制12%的牛乳，经115℃灭菌10min后，在复原牛乳中分别接入瑞士乳杆菌LH-B02、保加利亚乳杆菌L.B 1482和嗜热链球菌S.T 6038，42℃静止培养24h为母发酵剂，在牛乳中接入10%的母发酵剂，42℃静止培养24h为工作发酵剂。

工作发酵剂活化数次后，参照刘占祥［10］等人的方法测定菌种活力，活力达到0.7时即可接种。

1.2.3.4 接种 分别添加2%的瑞士干酪乳杆菌（Lactobacillus helveticus LH-B02），1.5%的保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus AS1.1482）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus IFFI6038），每种处理做3个平行，混匀后42℃静止培养4h后取出，4℃后熟24h。

1.2.4 发酵豆乳和发酵纯牛乳各项指标的测定

1.2.4.1 pH的测定 用Seven Easy pH计（S20）测定样品的pH。

1.2.4.2 酸度的测定 以涅尔度°T为酸度测定指标，按GB/T 5009.46-2003《乳与乳制品卫生标准的分析方法》测定。

1.2.4.3 质构的测定 本实验具体的TPA测试参数为：T.P.A测定模式，预压速度1.0mm/s，测定时探头速度1.0mm/s，压后速度1.0mm/s，下压比例30%，探头型号SMSP/0.5，数据获取速度200pps，温度为室温，样品厚度5cm。

1.2.4.4 感官描述 分别对发酵制品的色泽、组织状态、口感和滋味等进行描述分析。

1.2.4.5 数据处理与分析 实验数据采用SPSS 13.0统计分析软件进行处理，进行一维方差分析。平均值和标准偏差由三个样品的测量结果经计算得到。

2 结果与讨论

2.1 大豆萌发过程中蛋白亚基组成含量的变化

从图1可知，大豆在整个萌发过程中，11S球蛋白的碱性亚基B（B3，B1a，B1b，B2，B4）电泳谱带并没有发生明显变化。而11S酸性亚基A3、A（A1a，A1b，A2，A4）及7S球蛋白的α′、α、β亚基在大豆萌发至2cm长时，电泳带开始变淡和模糊，在3cm时电泳带变深，但从4cm开始随着豆芽长度的增加而逐渐变淡。其中，豆芽长至4cm和7cm长时，A3亚基和α′、α亚基的电泳带均已基本消失。

图1 大豆种子萌发过程中蛋白亚基组成SDS-PAGE图谱

大豆在萌发过程中产生的内源蛋白酶能够降解储藏蛋白，为豆芽及幼苗的生长提供物质基础。焉华娟等人［7］研究发现，大豆萌发至48h（2cm）时，内源蛋白酶活力出现峰值，具有较高的酶活性，稍有下降后维持在稳定水平。可见，大豆萌发至2cm时，11S球蛋白酸性亚基A3、A及7S球蛋白的α′、α、β亚基开始被内源蛋白酶降解，而长至3cm时，由于蛋白酶活性稍有下降，且部分蛋白质可能被重新合成，所以亚基组成含量有所回升。

大豆在萌发到2cm至3cm时，大分子的储藏蛋白亚基开始出现一定程度的降解，但又未被过多地降解，较符合下一步的实验要求，因而选择2～3cm长的豆芽作为原料，用于制作萌发大豆发酵豆乳。

2.2 发酵纯牛乳及发酵豆乳的pH及酸度的分析比较

表1所示，0cm和2～3cm发酵豆乳的pH均可达到4.0以下，而发酵纯牛乳的pH则为4.19±0.010，表明LH-B02、L.B 1482及S.T 6038混合发酵剂能够更好地利用牛乳和豆乳中的蛋白质成分进行发酵，产生更多的游离H离子，因而发酵豆乳的pH更低。

酸度是评价酸奶品质的一项重要指标，发酵豆乳的酸度均能达到85°T以上，符合《GB19302-2003酸乳卫生标准》中发酵纯牛乳的酸度要求（≥70°T）。而发酵纯牛乳的酸度更是高达105.97±0.912°T，可见加入瑞士乳杆菌能提高发酵豆乳的酸度值，且其在牛乳中也有很强的产酸能力［11］。

表2 发酵纯牛乳和发酵豆乳质构特性的比较

统计学分析发现，0cm和2～3cm发酵豆乳的pH及酸度值并无显著性差异（p＞0.05），可见大豆萌发至2～3cm时，其11S球蛋白酸性亚基A3、A及7S球蛋白的α′、α、β亚基的降解，并不会对组合发酵菌种的生长情况及产酸能力产生太大的影响。

2.3 质构特性的分析比较

T.P.A（Texture Profile Analysis）通过模拟人口腔的咀嚼运动，对样品进行两次压缩［12］，质构分析仪经微机将质构测试曲线输出，得出各项质构特性参数，各发酵制品的质构测定结果如表2所示。

研究显示，除弹性略有下降外，2～3cm发酵豆乳的质构参数均与发酵纯牛乳相近，且硬度和脆度及胶性均比0cm发酵豆乳低（P＜0.01），而粘附性及凝聚性则有增加（P＜0.01）。

硬度（Hardness）是第一次压缩样品时产生的最大峰值，大多出现在最大变性处［12］，模拟牙齿压缩样品需要的力。脆度（Fracturability）是第一次压缩过程中样品出现破裂现象时的峰值［13］，模拟牙齿咬样品直至样品破裂所用的力。粘附性（Adhesiveness）模拟人口腔舌头离开样品所用的力［12］。大豆经过萌发后，发酵豆乳的硬度和脆度分别下降了38.61%和38.85%，粘附性从-86.779±12.017g·s增加至-52.172±12.312g·s，口感更为粘稠，与发酵纯牛乳十分相近。发酵纯牛乳的凝胶结构是由一些裸露的、大小不同的球形酪蛋白分子堆积而成酪蛋白粒子网络结构，有游离末端的暴露，几乎没有形成链状结构［14］，因而具有较低的硬度、脆度。大豆球蛋白是分子量为300～380kDa的六聚体，每个亚基均由一条酸性和碱性多肽链组成，通过二硫键进行结合，且各个亚基上还分别含有2～3个胱氨酸和半胱氨酸侧链残基［8］，因而整个分子显得较致密，分子刚性较强，凝胶结构较坚硬而质脆［15］。Utzumi等人发现在形成大豆蛋白凝胶过程中，11S球蛋白的碱性多肽链可与7S的β亚基相互作用形成可溶性聚集体［16］。大豆在萌发过程中，部分降解的7Sβ亚基使大豆蛋白凝胶中可溶性聚集体形成减少；而豆芽中产生的内肽酶能够降解大豆蛋白质为长短不一的大豆多肽片段［7］，分子结构变得疏松，使萌发大豆制成的发酵酸乳凝胶三维网络结构交联度下降，分枝减少［17］。其交联网络结构中的羧基、羟基、羰基等亲水基团更多地暴露出来，更多的水分进入大豆蛋白凝胶复合体系中［18］，使萌发大豆发酵豆乳的凝胶三维网络结构更为疏松，脆性下降，粘附性增加，更接近发酵纯牛乳疏松的凝胶结构，口感表现为更细腻柔软粘稠。

胶性（Gumminess）用于描述半固体样品的黏性特性，其模拟评估食品解聚前需要用舌头对上颚进行操作的次数［19］。实验表明，萌发使发酵豆乳的胶性下降，更为接近发酵纯牛乳的黏性口感。凝聚性（Cohesiveness）用于评估口腔咀嚼时样品破裂前变形所需的力［13］，其取决于样品结构内部结合的强度［19］。经统计学分析，2～3cm发酵豆乳的凝聚性更高（P＜0.01），更接近发酵纯牛乳的凝聚性，表明发芽大豆发酵豆乳样品内部结合强度较 0cm的大。弹性（Springiness）模拟口腔压缩样品，移去压力后样品的恢复度和时间有关，停隔的时间越长，恢复的高度越大［19］。与发酵纯牛乳不同，发酵豆乳主要由分子结构紧密的大豆蛋白质发酵而成，因而弹性稍有下降。

2.4 感官描述比较分析

与未萌发大豆（0cm）相比，萌发大豆（2～3cm）的发酵豆乳制品颜色稍白些，更接近发酵纯牛乳乳白色的色泽。从组织状态而言，发酵纯牛乳、发酵豆乳的凝乳结构都比较均匀，表面光滑无气泡和裂缝；牛乳中含有较多乳清蛋白，因而发酵纯牛乳有少量乳清析出，而发酵豆乳均无乳清析出。与发酵纯牛乳相比，0cm发酵豆乳质地稍硬些，入口时有颗粒感，而2～3cm发酵豆乳凝乳结构更为细腻、质地更柔软粘稠，入口无明显颗粒感，更接近发酵纯牛乳的口感。这是由于豆芽中的内源蛋白酶水解大豆蛋白质为大豆多肽，因而利于形成更为细腻、柔软的凝乳三维网络结构。

大豆的豆腥味是由大豆脂肪氧化酶（Lipoxygenase）催化亚油酸、亚麻酸等多不饱和脂肪酸酶促反应生成醛、酮等异味物质而导致的［20］。大豆萌发后，发酵豆乳已无明显豆腥味和豆味，这可能是由于经降解产生的大豆多肽能与底物竞争酶的活性部位，抑制了脂肪氧化酶的活性［21］，导致脂肪氧化酶活性降低了43%［5］，进而消除了萌发大豆发酵豆乳的豆腥味和豆味。

表3 发酵纯牛乳和发酵豆乳的感官描述比较

3 结论

3.1 经SDS-PAGE分析萌发过程中大豆蛋白质亚基组成的变化情况，发现大豆在萌发至2～3cm时，11S球蛋白酸性亚基A3、A（A1a，A1b，A2，A4）及7S球蛋白α′、α、β亚基开始被降解，且随着芽长的增加，降解程度增加。

3.2 萌发至2～3cm的大豆所制成的发酵豆乳，色泽呈均一的微黄色，组织细腻均一、具发酵豆乳固有的乳香味和豆香味，无明显豆腥味和豆味，口感爽滑。在42℃经组合益生菌发酵剂培养4h后，pH低至4.0，酸度达85°T以上，酸甜适中。硬度和脆度分别比未萌发大豆发酵制品下降了38.61%和38.85%，粘附性从-86.779g·s增加至-52.172g·s，质构特性与发酵纯牛乳的十分接近，远优于非萌发大豆发酵豆乳制品。

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Study on the production of probiotics fermented soy yogurt by germinated soybean

YANG Mei，LI Li*
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The changes of soybean protein subunit content during soybean germination were studied by using SDS-PAGE.2cm to 3cm long germinated soybeans were fermented by Lactobacillus helveticus LH-B02，Streptococcus thermophilus lFFl 6038 and Lactobacillus bulgaricus AS1.1482 as the main materials.The result indicated that hardness and fracturability were decreased by 38.61%and 38.85%respectively，compared with un-germinated soymilk yogurt.Meanwhile，adhesiveness was increased from-86.779g·s to-52.172g·s.The taste，flavor and texture properties of the germinated soymilk yogurt were evidently improved and similar to yogurt.

soybean germination；soy yogurt；fermented milk；protein subunits；texture properties

TS214.2

A

1002-0306（2010）11-0206-04

2009-10-19 *通讯联系人

杨媚（1986-），女，在读硕士生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。