两种不同离子层析法分离鸡蛋溶菌酶的比较研究

张新宝，陈红兵，高金燕

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西南昌330047；3.南昌大学食品系，江西南昌330047）

两种不同离子层析法分离鸡蛋溶菌酶的比较研究

张新宝1，2，陈红兵1，2，高金燕1，3，*

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西南昌330047；3.南昌大学食品系，江西南昌330047）

以鸡蛋溶菌酶的主要分离方法—阳离子交换法与阴离子交换法为对象，从分离的回收率、鸡蛋溶菌酶纯度以及样品处理周期等方面进行比较研究。研究结果显示，两种方法均能较好地分离鸡蛋溶菌酶。阴离子交换法分离出的鸡蛋溶菌酶纯度更高，纯度＞90%，并且分离周期短，操作更方便，但其回收率为20.7%，而阳离子交换法的为31.1%，阴离子交换法更适合于制备高纯度的蛋清溶菌酶。

溶菌酶，离子层析，分离纯化

鸡蛋溶菌酶因其天然的杀菌抑菌作用而作为一种食品防腐剂被广泛应用于各类食品行业之中，并且，它仅由一条多肽链组成，结构相对简单，历来作为一种模式蛋白被用来研究蛋白质的结构和功能，因此，鸡蛋溶菌酶分离纯化工作一直不断受到许多科研工作者的青睐。鸡蛋溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17），又称N-乙酰胞壁质酶，是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁的水解酶，由129个氨基酸残基构成，其分子量约为14.3kDa。因鸡蛋溶菌酶含有大量的组氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺以及天冬氨酸等碱性氨基酸，其等电点pI为10.7，为典型的碱性蛋白质，在酸性或近中性环境中带有大量的正电荷，能选择性吸附在阴离子交换分离介质上，从而与蛋清中其他蛋白质分离开来。因此，阳离子交换法在分离鸡蛋溶菌酶上更容易受到关注，其中已有大批科研工作者从分离介质的选择、不同因素对鸡蛋溶菌酶分离效果的影响、工艺过程控制等方面对阳离子交换法做了深入研究［1-6］，尤其以Xue等人研究得出的分离条件较为成熟［7］。另外，还有极少数文献报道使用阴离子交换树脂分离溶菌酶。来自吉林大学的李欣使用DEAE-纤维素阴离子交换柱法分离蛋清溶菌酶，以pH10.0的Tris缓冲液作为洗脱液［8］。但至今还未见有文献报道比较研究以上两种分离方法的优劣之处，因此，本研究在参考相关文献报道的基础上，分别对这两种分离方法进行改进，进而比较研究它们在分离鸡蛋溶菌酶上的分离效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜鸡蛋 购于市场；鸡蛋溶菌酶标准品 电泳纯级，sigma公司；牛血清白蛋白 电泳纯，中国医学科学院血液学研究院；其他常用生化试剂 分析纯。

柱材CM-葡聚糖阳离子凝胶树脂、DEAE-葡聚糖阴离子凝胶树脂 法码西亚公司；恒流泵HL-2、自动部分收集器BSZ-160、TH-500A梯度混合器上海青浦沪西仪器厂；HD-93-1型紫外检测仪 上海金达生化仪器厂；垂直电泳系统、凝胶成像系统Bio-Rad公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司；分蛋器。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋清预处理 取新鲜鸡蛋，先洗净，在蛋壳一端破壳，分蛋器分离蛋清，加入等体积的蒸馏水，轻轻搅拌均匀，以不起气泡为宜，再用三层纱布过滤不溶物，调节蛋清滤液 pH至6.1，4℃冰箱静止5h，3000r/min离心5min，过滤除去沉淀物，再调pH至4.5，同样条件下静止5h，过滤除去沉淀物，将滤液放于-20℃冰箱内备用。

1.2.2 CM-阳离子交换法分离溶菌酶 参照Timothy D等人的实验方法［4］，对其稍作改进。首先将CM-葡聚糖凝胶G-50经酸、碱预处理，装柱，水洗至中性，然后用浓度为0.05mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡3～4h，直至核酸蛋白检测仪数值稳定下来，然后上样5mL，再用含0.5mol/L NaCl的上述磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，控制流速为1.5mL/min，依据记录仪记录下的洗脱峰收集洗脱液，-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 DEAE-阴离子交换法分离溶菌酶 经过预处理的DEAE-葡聚糖凝胶装柱后，先用蒸馏水洗至中性，然后用pH7.5的Tris缓冲液平衡3～4h至核酸蛋白检测仪数值恒定，经调零后，上样5mL，继续用上述Tris缓冲液，采用与步骤1.2.2相同的流速条件进行洗脱，待穿过峰洗脱下来后，立即改用含1.2mol/L NaCl的Tris缓冲溶液进行洗脱，收集穿过峰对应的洗脱液，-20℃冰箱保存备用。

1.2.4 SDS-PAGE鉴定蛋白成分及纯度 参照《生物化学实验原理与方法》，通过SDS-PAGE电泳鉴定上述两种分离法分离得到的样品中蛋白成分。本实验采用15%的分离胶和5%的浓缩胶，使用考马斯亮蓝法染色，以标准蛋白maker（11～170kDa，Sigma）确定蛋白质分子量，同时与1mg/mL的溶菌酶标准品做电泳比对，确定分离样品的纯度。

1.2.5 溶菌酶回收率的测定 参照Folin-酚法，分别测定两种方法分离得到的样品中蛋白质浓度，计算蛋清溶菌酶回收率。以牛血清白蛋白作为标准蛋白制定标准曲线。

2 结果与分析

2.1 CM-阳离子交换法分离溶菌酶

CM-阳离子交换法分离鸡蛋蛋清溶菌酶如图1（A）所示。该方法将蛋清蛋白分离为三个峰，它们之间都有一定的间隔，说明后面的两种蛋白质得到了很好的分离，从后面的SDS-PAGE电泳实验结果（图2）得知，峰Ⅲ对应的样品为溶菌酶，计算其分离度R=2.53，说明CM-阳离子交换法能够将鸡蛋溶菌酶很好地分离开来。

图1 离子交换法分离鸡蛋溶菌酶洗脱曲线

2.2 DEAE-阴离子交换法分离溶菌酶

图1（B）所示为阴离子交换法分离溶菌酶的洗脱曲线，从图可以看出，鸡蛋蛋清蛋白仅被分离为峰Ⅰ和峰Ⅱ两部分，它们之间间隔显著，其分离度R= 4.4，也说明这两种蛋白质被充分的分离开来。图2的电泳结果显示峰Ⅰ对应的样品为蛋清溶菌酶。通过A、B两条洗脱曲线，我们可以看出，使用阴离子交换法仅需要30体积的洗脱液就能够将鸡蛋溶菌酶从蛋清蛋白中分离开来，较阳离子交换法少用大约15体积的洗脱液，既省时，又省料。

2.3 SDS-PAGE鉴定蛋白质成分

图2为SDS-PAGE电泳图。与蛋白marker相比较，阳离子交换法中峰Ⅲ和阴离子交换法中的峰Ⅰ对应的样品D1、D2在电泳泳道的下部都出现了一清晰的条带，蛋白质分子量约为14kDa，可以确定该蛋白质为鸡蛋溶菌酶。与电泳纯溶菌酶标准品S（纯度＞90%）相比较，阴离子交换法分离得到的样品D1中仅含有一个条带，可以说明该方法分离得到的鸡蛋溶菌酶纯度＞90%，而用阳离子交换法分离得到的样品D2经SDS-PAGE电泳后，泳道中还出现了一条暗淡的条带N，说明其中还含有少量的杂质。因此，阴离子交换法分离得到的样品纯度更高。

2.4 溶菌酶回收率

两种方法分离得到的蛋清溶菌酶样品的蛋白浓度及蛋清溶菌酶回收率如表1所示。鸡蛋溶菌酶约占蛋清总蛋白的3.4%［9］，以此为依据计算得这两种方法分离得到的蛋清溶菌酶的回收率分别达31.1%和20.7%，高于Xue等人所得实验数据20%。

表1 两种离子交换所得鸡蛋溶菌酶回收率对照表

图2 SDS-PAGE电泳图

3 讨论

研究结果显示，这两种蛋清溶菌酶的分离方法都取得了较好的分离效果。对比Xue等人的洗脱曲线（图1 C），这两种方法分离得到的洗脱峰比较集中，洗脱体积小，省时又省料，并且分离出的洗脱峰少，仅仅是将蛋清溶菌酶分离开来，杂蛋白基本都集中在一起，有利于其他杂蛋白的再利用，提高资源利用率，非常适合于鸡蛋溶菌酶的工业化生产。

但是对比研究这两种分离方法会发现，它们的分离效果仍然有很大差别。虽然阳离子交换法也能够将蛋清溶菌酶与其他杂蛋白分离开来，但是从图2可以发现，其中仍然含有少量的杂蛋白，这与Xue等人采用阳离子交换法粗分离蛋清溶菌酶得到的结果一致，其中的原因可能是蛋白与分离介质之间不仅有正负离子的相互作用，还有一定的范德华力，使得少量杂蛋白不能经磷酸盐缓冲液完全洗脱下来，而在后来的盐离子竞争作用下随溶菌酶一起洗脱下来。阴离子交换法分离溶菌酶曲线显示，蛋清溶菌酶的分离度R=4.4，远大于阳离子交换法的分离度，并且阴离子交换法分离得到的溶菌酶通过SDS-PAGE电泳检验并未发现有杂蛋白，说明其纯度较阳离子交换法有明显提高，接近或超过电泳纯级蛋清溶菌酶标品的纯度（＞90%）。另外，从两种离子层析洗脱曲线上，我们也可以看出阴离子交换法的样品分离周期更短，仅为阳离子交换法的66.7%左右。

在计算鸡蛋溶菌酶回收率时，我们以Stevens等人报道鸡蛋溶菌酶占蛋清总蛋白的比例为依据粗略计算出其回收率［9］。计算结果表明，阳离子交换法制备的溶菌酶回收率要高于阴离子交换法，究其原因，阳离子交换介质几乎吸附了蛋清上样液中所有的鸡蛋溶菌酶，在后来的高盐离子竞争作用下被完全洗脱下来；而用阴离子交换介质分离时，有部分溶菌酶通过分子间范德华力被吸附在分离介质上没有随穿过峰一起洗脱下来，而在随后的介质再生过程中与杂蛋白一起被洗脱下来，致使部分鸡蛋溶菌酶损失，故其回收率远低于阳离子交换法的31.1%，但仍与Xue等人报道的20%的回收率基本一致。

总结以上两种分离方法，我们可以发现，阴离子交换法程序相对简单、洗脱时间短、蛋白纯度高，更适合于制备高纯度的蛋清溶菌酶。

［1］常凯，邸海洋，何昭阳.溶菌酶的提取及其在焙烤食品中的应用［J］.食品科技，2008（10）：167-169.

［2］史小利，李宗谦，徐淑霞，等.蛋清溶菌酶提取工艺研究［J］.动物科学，2008（6）：166-168.

［3］张文会，王艳辉，马润宇.离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶［J］.食品工业科技，2003，24（6）：57-59.

［4］L ockey T D，O urth D D.Purification and characterization of lysozyme from hemolymph of Heliothis virescens larvae［J］. Biochem Biophys Res Commun，1996，220（3）：502-508.

［5］ThammasirirakS，Ponkham P，Preecharram S，etal. Purification，characterization and comparison of reptile lysozymes［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2006，143（2）：209-217.

［6］Dismer F，Petzold M，Hubbuch J.Effects of ionic strength and mobile phase pH on the binding orientation of lysozyme on different ion-exchange adsorbents［J］.J Chromatogr A，2008，1194（1）：11-21.

［7］Xue Q G，Schey K L，Volety A K，et al.Purification and characterization of lysozyme from plasma of the eastern oyster（Crassostrea virginica）［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2004，139（1）：11-25.

［8］李欣.鸡蛋清溶菌酶的精致［D］.吉林大学，2006.

［9］Stevens L.Egg white proteins［J］.Comp Biochem Physiol B，1991，100（1）：1-9.

Comparison of two different ion chromatography methods in purification of egg white lysozyme

ZHANG Xin-bao1，2，CHEN Hong-bing1，2，GAO Jin-yan1，3，*
（1.State Key Laborary of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；
2.Sino-German Joint Research Institude，Nanchang University，Nanchang 330047，China；3.Department of Food Science，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Anion chromatography and cation chromatography，which were the major methods in separating egg lysozyme，were investigated to compare their difference in the recovery rate，the resulting purity of lysozyme，and the time needed in separating the samples.Results showed both of the two methods could separate egg white lysozyme effectively.Specifically，the result of anion chromatography showed a higher purity，which was more than 90%.And it was also much more convenient and time-saving.However，the recovery rate was 20.7%，less than that of cation chromatography which was 31.1%.So anion chromatography was more preferable to purify egg white lysozyme with high purity.

lysozyme；ion chromatography；purification

TS201.2+5

B

1002-0306（2010）11-0283-03

2009-10-26 *通讯联系人

张新宝（1980-），男，硕士研究生，研究方向：食品营养与安全。

教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-08-07-04）；江西省自然科学基金（2008GZN0040）；南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索项目（SKLF-TS-200820）。