具有抑制单胺氧化酶活性的干酪乳杆菌JH-23生长特性及生理功能研究

王 豪，郭本恒，王荫榆，吴正钧

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.光明乳业股份有限公司技术中心，上海200436）

具有抑制单胺氧化酶活性的干酪乳杆菌JH-23生长特性及生理功能研究

王 豪1，郭本恒2，*，王荫榆2，吴正钧2

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.光明乳业股份有限公司技术中心，上海200436）

以具有体外抑制单胺氧化酶作用的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）JH-23作为研究对象，考察了其部分生长特性和生理功能。L.casei JH-23属于厌氧型的革兰氏阳性杆菌，无芽孢。该株菌的最适生长温度为37℃，最适生长pH为6.0，最适接种量为3%，MRS中24h培养结束后活菌数可达1.11×109cfu/mL，在脱脂乳中具有良好的保藏性能。生理功能实验显示，L.casei JH-23在pH为3.0的环境下生长3h后存活率可达到65.32%，对酸性环境有较强的耐受性；最高胆盐耐受浓度为0.5%，最高NaCl耐受浓度为6%，这些结果表明，L.casei JH-23作为益生菌有着很好的工业应用价值和发展潜力。

干酪乳杆菌JH-23，生长特性，生理功能

益生菌是一类通过改变宿主某一部位菌群的组成，从而产生有利于宿主健康作用的单一或组成明确的混合微生物。益生作用则是指某种微生物制剂或发酵制品通过调节宿主黏膜与系统免疫功能以及改善肠道营养与菌群平衡对宿主所产生的有益的生理作用［1］，益生作用的范围可分为营养、生理作用和抗菌作用。鉴于益生菌众多的功能性作用，目前已将其应用于商业化生产，主要的益生菌有双歧杆菌和乳杆菌等。近年来关于益生菌降血脂、抗高血压、降胆固醇等功能性作用已得到证实，但对于益生菌的抗衰老作用研究的很少。前期实验中筛选出一株具有抑制单胺氧化酶活性的干酪乳杆菌JH-23，单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO，EC 1.4.3.4）在机体内的主要功能是催化内源性和外源性单胺类物质的代谢。人体中MAO的含量从45岁起随年龄的增加而急剧增加，被认为是老化的标志，又称之为老化相关酶，该酶活性的不断升高会引起整个机体逐步衰老［2］。据报道，帕金森病、老年痴呆病以及近年来都市中较为流行的抑郁症等病理性衰老疾病均与MAO活性异常有关［3-4］，说明MAO与衰老有密切关系。MAO直接涉及到了人体的衰老过程，其含量与年龄的增加成正相关，是衰老的特征指标，因此筛选出的MAO抑制剂意味着有潜在的抗衰老作用。有鉴于此，具有抑制MAO活性的干酪乳杆菌JH-23将来可能会应用到食品特别是乳品中，开发辅助抗衰老作用的功能性乳制品，以满足人们健康的需要。所以有必要对该干酪乳杆菌的一些生长特性和生理功能进行研究，从而更好地了解该益生菌的特性。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

菌种 前期实验筛选并鉴定得到的干酪乳杆菌JH-23；牛磺胆酸钠 Sigma公司；溴甲酚紫 国药集团化学试剂有限公司；MRS固体培养基及液体培养基 Merck公司；其它为实验室常规分析纯化学试剂。

Avanti J30I高速冷冻离心机 Beckman Coulter公司；TH-CB-402型超净工作台 LABCONCO公司；厌氧培养箱 英国RUSKINN TECHNOLOGY LIMITED公司；PHS-25型pH计 奥立龙公司；恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；SPECORD 205型紫外分光光度计 德国耶拿公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株生长特性研究

1.2.1.1 菌落和菌体形态以及液体培养特征观察L.casei JH-23在MRS平板划线分离，37℃厌氧培养48h，观察菌落形态；同时按1%接种量接到MRS液体中，37℃培养24h，观察液体生长情况。接种环挑取6h培养液到载玻片涂片，革兰氏染色，显微镜观察菌体形态并摄影记录。

1.2.1.2 菌株最适生长温度和最适生长pH的测定［5］L.casei JH-23按1%接种量接入MRS-broth，放置于不同温度（25、30、34、37、40、45℃）培养16h，以没有接种的培养基作参比，于620nm测定培养液的光密度值，依据光密度的大小确定最适生长温度。

同时接种JH-23到不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的MRS液体培养基中，在最适温度下培养16h，以没有接种的同pH液体培养基作参比，于620nm测定培养液的光密度值，依据光密度的大小确定最适生长pH。

1.2.1.3 菌株生长最适接种量的测定 以接种量（1%、3%、5%、7%、9%）将种子液接入MRS-broth中，37℃静置培养16h后，采用倾注平板法进行活菌计数，以活菌数作为最适接种量的指标。

1.2.1.4 菌株产酸能力检验和生长曲线的绘制［6］活化好的菌株JH-23按1%接种量接于200mL MRS培养基中，37℃恒温培养24h，每隔2h测定培养液中的活菌数和pH。发酵液pH用pH计测定，活菌数采用平板计数法，以活菌数对数值和pH对时间作图，得到菌株的生长曲线。

1.2.1.5 菌株保藏特性研究方法 L.casei JH-23按1%量接入MRS液体，收集到达对数生长期末的菌液，一部分以MRS发酵原液形式放入冰箱4℃保存；另一部分3000×g，4℃离心15min收集菌体，无菌水洗涤两次，菌体悬浮在10%的SKM中，放入冰箱4℃保存。采用MRS琼脂培养基，在第0、7、14、21d分别对两种保藏液体中的活菌计数。

1.2.2 菌株生理功能研究

1.2.2.1 菌株耐酸能力测定［7］L.casei JH-23按1%接种量接入MRS液体培养基，37℃培养24h，培养液3000×g，4℃离心15min收集菌体，收集的菌体用灭菌的生理盐水洗涤3遍。之后菌体分别悬浮于pH为2.0、3.0、4.0和5.0的MRS液体培养基中，以pH为5.7±0.2的MRS液体培养基为常规对照，37℃培养3h，测定存活率。

1.2.2.2 菌株胆盐耐受能力的测定［8］将活化的菌株按1%的接种量接种于含不同浓度牛磺胆酸钠（TCA）的MRS液体培养基中，37℃恒温培养，于0h和16h分别测定OD620，计算两者差值；同时在不同TCA浓度的MRS琼脂平板上划线，37℃厌氧培养48h后观察生长情况。

1.2.2.3 菌株对NaCl耐受性的测定［9］在MRS液体管中加入NaCl（质量分数分别为0%、2%、4%、6%、8%、9%、10%、11%），灭菌后接种，37℃厌氧培养，以溴甲酚紫为指示剂，观察培养基颜色变化和菌体生长情况。

2 结果与讨论

2.1 菌株生长特性研究

2.1.1 L.casei JH-23菌落和菌体形态以及液体培养特征观察 L.casei JH-23在MRS平板上划线分离，其菌落形态如图1-A所示：菌落直径为0.3～2mm，圆形，边缘整齐，正面凸起，乳白色，不透明，表面湿润光滑。JH-23为G+，杆状细菌，不产芽孢，菌体大小为0.4～1.0μm宽，2～8μm长，具体的菌体形态如图1-B。

L.casei JH-23在液体MRS中培养，4h左右培养液开始浑浊并伴有菌体细胞沉淀物产生，12h左右生长物均匀浑浊，轻轻摇动没有气泡产生，16h有大量菌体沉淀，沉淀结构疏松，24h乳白色沉淀明显。

图1 JH-23的菌落和菌体形态

2.1.2 L.casei JH-23的最适生长温度 确定菌株在不同温度下的生长情况对于其保存和处理具有指导意义，L.casei JH-23的最适生长温度如图2所示。

从图2中可以看出，L.casei JH-23在25℃及45℃时生长缓慢，30～40℃间生长较好，该菌株的最适生长温度为 37℃，与一般乳酸菌的最适温度相似［10］。

2.1.3 L.casei JH-23的最适生长 pH 将 L.casei JH-23接种到不同起始pH的MRS液体试管中，37℃静置培养，测定菌株在不同pH条件下培养16h的OD620，结果如图3。

图2 L.casei JH-23的最适生长温度

图3 L.casei JH-23的最适生长pH

从图3可以看出，L.casei JH-23在pH4.0至10.0的范围均可生长，其最适生长pH为6.0。

2.1.4 L.casei JH-23的生长最适接种量 图4显示，按3%（v/v）接种量将L.casei JH-23接入MRS液体培养基中，37℃下培养16h，活菌数可达到1.18× 109cfu/mL。相对于其它接种量而言，3%接种量所得到的发酵液中活菌数最多，即最适接种量为3%。

图4 L.casei JH-23的最适接种量

2.1.5 L.casei JH-23生长曲线的测定 菌株的生长过程可以通过细胞数的测定和培养基pH变化来反映，其比较直观地体现出乳酸菌在一定条件下的群体生长规律。

按上述实验结果，将活化好的L.casei JH-23按3%（V/V）的接种量接入MRS-broth培养基中，37℃恒温培养，每隔2h取样测定其发酵液中的活菌数量和pH，得到如图5的生长曲线。

图5显示，在MRS培养基中，JH-23在2h进入对数生长期，12h左右进入稳定期。进入稳定期前，随着培养时间的增加，pH不断降低。进入稳定期后，pH下降趋势渐缓。说明稳定期JH-23仍在生长，只是生长和死亡形成动态平衡［11］，24h培养结束，pH为3.70，培养液中 JH-23活菌浓度为 1.01× 109cfu/mL。

2.1.6 L.casei JH-23在4℃的保藏特性 在4℃保藏过程中，于第0、7、14、21d分别测定菌株在MRS和 SKM中的活菌数，以log10活菌数对天数（d）作图，如图6得到L.casei JH-23在4℃的保藏特性曲线。

图5 L.casei JH-23在MRS中的生长曲线

图6 L.casei JH-23在MRS发酵液（A）和脱脂乳（B）中的保藏曲线

从图6可以看出，L.casei JH-23的活菌数对数值随保藏时间的增加呈线性下降，L.casei JH-23在pH 3.7的MRS和pH 6.2的SKM中4℃保藏，活菌数减少一个数量级所需时间分别为18.13d和42.76d。可见，悬浮L.casei JH-23在中性SKM中，具有良好的保藏性能。

2.2 菌株生理功能研究

2.2.1 L.casei JH-23耐酸性实验 微生态制剂经口服后首先到达胃，这就要求乳酸菌要具有较强的耐酸能力，才能够保证一定数量的活菌顺利通过胃酸环境而到达肠内。胃液pH的大小根据饮食结构不同而波动很大，通常pH为3左右，空腹或食用酸性食品时，pH可达1.5；食用碱性食物时，pH为4～5，且食物（尤其是流体）通过胃的时间相对较短，一般为1～2h［12］。

图7 L.casei JH-23的耐酸能力

由图7可见，L.casei JH-23的存活率随着培养基pH的降低而下降，在pH为3.0的环境下生长3h后存活率可达到65.35%，pH2.0时虽然有大量活菌死亡，但仍有部分细菌存活下来，存活率为15.46%，说明该菌株对酸性环境有较强的耐受力。

2.2.2 L.casei JH-23耐胆汁盐实验 微生物对胆盐的抗性是其能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一。牛磺胆酸钠（TCA）是胆盐中的主要成分，在此次实验中作为菌株胆盐耐受力的指标，L.casei JH-23在不同TCA浓度的MRS培养基中的生长情况如表1所示。

表1 L.casei JH-23对不同浓度胆盐的耐受性（n=3）

人体小肠中胆盐含量在0.03%～0.3%之间，能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道转运过程中存活［13］。如表1所示，L.casei JH-23所能耐受MRS中胆盐的最大浓度为0.5%，较小肠内最高胆盐含量（0.3%）要高，作为益生菌具有较强的胆盐耐受力。

2.2.3 L.casei JH-23的NaCl耐受性 菌株的NaCl耐受性也是菌株的重要特性之一，其耐受值的高低体现了菌株所能耐受的渗透压以及在肠道中存活能力的高低，L.casei JH-23的NaCl耐受性如表2所示。

表2 L.casei JH-23菌株在不同NaCl浓度培养基中生长情况

由表2可见，L.casei JH-23在质量分数低于4%的NaCl浓度下生长良好，在6%的浓度下生长一般，而在8%的NaCl浓度下略有生长，NaCl浓度9%以上不生长，所以L.casei JH-23能够耐受质量分数6%的NaCl。

3 结论

本实验针对具有体外抑制MAO活性的L.casei JH-23的部分生长特性和生理功能进行了研究。菌株JH-23属于厌氧型的革兰氏阳性杆菌，无芽孢。最适生长温度为37℃，最适生长pH为6.0，最适接种量为3%。MRS培养基比脱脂乳培养基更适合其生长，MRS中 24h培养结束后活菌数可达 1.11× 109cfu/mL，但该菌株在脱脂乳中具有更优的保藏性能。

L.casei JH-23在pH为3.0的环境下生长3h后存活率可达到65.32%，对酸性环境有较强的耐受性，其最高胆盐耐受浓度为0.5%，最高NaCl耐受浓度为6%，这些结果表明L.casei JH-23作为益生菌有较好的工业应用价值和发展潜力。

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Study on the growth characteristics and physiological functions of Lactobacillus casei JH-23 having monoamine oxidase-inhibitory effect

WANG Hao1，GUO Ben-heng2，*，WANG Yin-yu2，WU Zheng-jun2
（1.Food College of Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Technology Center of Bright Dairy Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

The partial growth characteristics and physiological functions of Lactobacillus casei JH-23 having monoamine oxidase-inhibitory effect were investigated in this study as a research object.The cells were Grampositive，rod-shaped and nonsporeforming.The optimal temperature，pH value and inoculum size of the bacterium were 37℃，6.0 and 3%respectively.The viable cell concentration of L.casei JH-23 could reach 1.11×109cfu/mL in MRS medium after 24h fermentation.ln the skim milk medium，the preservation property of JH-23 was favorable.The experimental results of physiological functions indicated that survival rate of L.casei JH-23 was 65.32%after growing for 3h in pH3.0 circumstance，while JH-23 presented high tolerance towards bile salt and NaCl，namely 0.5%and 6%respectively.lt was revealed that L.casei JH-23 possessed great industrial application value and development potential as a probiotic.

Lactobacillus casei JH-23；growth characteristics；physiological functions

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0168-04

2009-09-27 *通讯联系人

王豪（1984-），男，硕士研究生，主要从事乳品微生物研究。

国家科技支撑计划“十一五”奶业重大专项（2006BAD04A14）。