高静压钝化树莓多酚氧化酶的动力学分析

江 俊，张 燕，廖小军，胡小松，孙志健

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

高静压钝化树莓多酚氧化酶的动力学分析

江 俊，张 燕*，廖小军，胡小松，孙志健

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

应用高静压技术钝化树莓中的PPO，以提高树莓加工产品的新鲜度和附加值。本文研究了高静压对树莓PPO的钝化效果，并应用一级动力学模型进行分析。研究结果表明，随着压力升高和持压时间的延长，树莓PPO的活性逐渐降低，但在低压短时处理下有激活现象，经600MPa，45min处理后树莓PPO残存活性为40.976%；高静压对树莓PPO的钝化过程符合一级动力学反应模型，压力对酶钝化反应的影响能用Eyring公式分析。随着压力升高，反应速率常数（k值）不断升高，指数递减时间（D值）不断减小；Zp和Va分别为917.431MPa和-6.020cm3/mol。

高静压，树莓，多酚氧化酶，动力学

树莓属蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus）植物，其果实中富含花青素、鞣花酸等大量的酚类物质，具有很高的营养价值，为越来越多的消费者所青睐。但由于树莓中存在大量的PPO，导致树莓及其加工制品在货架期发生褐变。为了抑制褐变，传统方法是通过热加工来钝化PPO的活性，但是它存在很多缺陷，诸如使产品新鲜度降低、风味和质地劣变、食品中的营养成分和一些功能性成分遭到破坏等，大大降低产品感官品质和市场价值。因此，寻找新的加工方法钝化树莓PPO，并减少对其营养物质的影响是提高树莓加工制品品质，实现高附加值的有效途径。高静压（High Hydrostatic Pressure，HHP）是目前发展最为成熟的一种非热力加工技术，它克服了热加工造成的种种弊端［1-2］，具有优良的技术特性。在国外，这一技术加工的果蔬产品已实现工业化。因此，应用高静压技术加工树莓是较好的选择。如上所述，内源PPO是影响树莓加工产品品质的重要因素。目前，国内外对高静压钝化PPO的研究也有广泛的报道。但众多的研究结果表明，受到PPO来源的影响，高静压对不同来源的PPO的钝化效果不尽相同，前人对草莓［3］、香蕉［4］、辣椒［5］、荔枝［6］、鳄梨［7］等果蔬进行高静压处理，其中的PPO被有效的钝化；而蘑菇［8-9］、葡萄［10-11］来源的 PPO对高压的耐受能力较强，不易被高压钝化。高静压对树莓PPO钝化的研究还未见相关报道，因此需要开展一些基本的实验研究，以利于将高静压技术应用于树莓的加工。本文通过研究高静压对树莓PPO的钝化效果，分析高静压钝化树莓PPO的动力学，以获得系统的数据，探知高静压钝化树莓PPO活性变化的规律，以改善树莓产品的颜色品质，提高其商品竞争力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

速冻红树莓（Rubus idaeus L.，Heritage variety）购于北京东方夏都树莓科技发展有限公司，冷链运输，到达后立即避光贮藏于-18℃；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯二酚、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylploypyrolidone，PVPP） 均为分析纯，购自北京蓝弋化学试剂公司；铝箔袋 购于北京华盾塑料公司。

EY-300A分析天平 日本松下电器；奥立龙868型pH计 美国奥立龙公司；ZHJ-308A1榨汁机烟台福山欧克电气用品公司；Hitachi himac CR21G高速离心机 日本日立公司；真空封口机 北京市瑞明星包装机械有限公司；Cary 50紫外分光光度计（带控温装置以及磁力搅拌装置） 美国瓦里安公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试样制备 配制含4%的聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）（w/v）的磷酸缓冲液（0.2mol/L的，pH=6.5）作为酶提取液。

称取树莓冻果250g，0℃解冻。加入250mL酶提取液，用榨汁机组织捣碎2min后，0～4℃下静置4h，23000g，4℃离心20min，上清液即为PPO粗提液。将粗提液按5mL的量分装于阻气防水耐压耐低温的铝箔袋中，立即放于-80℃超低温冰箱冷冻，待PPO粗提液中心温度达到-80℃后，迅速真空封口并迅速放回-80℃超低温冰箱中保存。

1.2.2 PPO酶活测定方法 PPO活性的测定采用分光光度法，反应底物为0.1mol/L的邻苯二酚溶液（pH=6.5）。30℃保温10min后，加入0.5mL树莓PPO粗酶液，立即在420nm处测定吸光值随时间的变化曲线，测定时间为15min，扫描时间间隔为0.1s，曲线直线部分的斜率即为酶活。

1.3 实验方案

设计压力梯度为 100、200、300、400、500、600MPa，时间梯度为5、15、25、35、45min。

1.4 数据统计与分析

1.4.1 酶活计算公式

表示1mL树莓粗酶液与过量底物反应420nm处吸光值的变化速率（ΔA420nm/min·mL）。

1.4.2 动力学分析 酶钝化过程应用一级反应动力学公式分析［3，12］：

At为处理tmin后残存的酶活，A0为初始酶活，k值（min-1）是在设定的压力和温度下的反应速率常数，D值（Decimal reduction time）是指数递减时间（min），即在设定的压力和温度下酶活降低一个对数（90%）所需要的时间。

ZP表示D值对压力的敏感性，即D值变化一个对数时对应的压力的变化。P1和P2表示D1和D2对应的压力。

评价压力对反应速率常数k的影响用Eyring公式（式 6）分析［13］，具体表现为活化体积（Va，cm3/mol）值的大小。其中P2和P1表示对应k1和k2的压力；RP是常数，为8.314J/（K·mol）。从公式6可以看出，Va可以从失活反应速率常数的自然对数ln（k）与压力P作图所得回归线的斜率中求得。

1.4.3 数据分析 数据分析采用方差分析（Analysis of variance，ANOVA）；使用Microcal Origin 7.5（美国Microcal公司）软件分析，采用0.05水平。

2 结果与讨论

2.1 高静压参数对树莓PPO活性的影响

图1为高静压处理压力对PPO活性的影响。如图所示，在压力影响下PPO的活性存在激活和钝化两种现象。在较短的持压时间下，随着压力的升高，PPO活性表现为先激活后钝化。在 100MPa和200MPa处理5min后，树莓PPO的活性分别提高了5.180%和8.868%（P＜0.05）。相似的现象在高静压处理苹果［14］、蘑菇［10］来源的PPO中也有报道。文献报道，PPO具有激活和潜伏两种存在形式［13］，并且有报道称高静压可能使潜伏态PPO转化为激活态表现催化活性［14］。因此推测高静压处理对PPO活性的影响是一个动态的过程，一方面高静压使部分PPO失活；另一方面，潜在形式的PPO被高压激活，呈现出来的酶活是两者共同作用的结果。而在较长的持压时间下，随着压力的升高，PPO活性逐渐降低，在100MPa和600MPa处理45min后，PPO相对活性分别降为87.428%和40.976%（P＜0.05）；与前人对草莓［3］、香蕉［4］、辣椒［5］、荔枝［6］、鳄梨［7］等来源的 PPO耐压性相比，树莓中的PPO保存了较高的相对活性，推测可能是由于树莓PPO对压力敏感性较弱，对压力的耐受较强而不易钝化。

图1 压力对树莓PPO活性的影响

2.2 高静压钝化树莓PPO的一级动力学分析

图2为树莓PPO在持续的高压和持压时间下活性的变化规律。如图所示，除了100、200MPa的较低压力短时条件下树莓PPO活性表现为激活外，树莓PPO活性整体表现为被高压钝化。进一步应用一级反应动力学公式分析高静压钝化树莓PPO的过程，如图2、表1所示。高静压处理后，所有压力下PPO的相对酶活取对数与处理时间有良好的线性关系，R2≥0.900，表明高静压对PPO的钝化符合一级动力学过程。从表1可以看出，随着压力升高，k值不断增大，压力从100MPa增加到600MPa，树莓PPO的钝化速率增加了近4倍，相应的D值逐渐减小，从100MPa时的 492.094min缩短至 600MPa时的127.520min，即钝化90%的酶活，600MPa较100MPa处理可以节约364.574min。表明压力对PPO的钝化有显著影响，提高处理压力能够有效提高钝化效率，缩短钝酶时间。通过比较k值的变化率，研究还发现100～500MPa时的k值增大速率介于11%～25%之间，而600MPa的k值比500MPa时增大80%，说明600MPa条件下对酶的影响更为剧烈。Montero等［15］用高压钝化对虾PPO也出现类似结果，该PPO活性经200MPa处理10min后残存酶活还有70%以上，但300MPa处理10min后残存酶活仅为25%，此时酶活降幅比其他条件明显剧烈。

图2 高静压钝化树莓PPO的动力学

表1 高静压处理钝化树莓PPO的动力学参数

D值对压力的敏感性用ZP来表示，ZP代表能导致D值变化一个对数值的压力变化，以logD为y轴，压力P为x轴，所得直线的斜率的倒数即为ZP值。如图3所示，高静压钝化树莓 PPO的 ZP值为917.431MPa。利用Origin软件分析可得到图4，利用Eyring公式（公式6）计算可得高静压处理条件下树莓PPO的活化体积Va为-6.020cm3/mol，相关系数R2=0.926。计算所得的Va为负值，说明随着压力的增加反应速率常数也在增大。与其他文献［7，11，16-17］中报道的数据相比，本实验所得Va值较低，表明树莓PPO高静压失活速率常数受压力的影响较小，即树莓PPO的耐压性较强。

3 结论

100～600MPa下，持压5～45min的高静压处理对树莓PPO有钝化效果，虽然低压短时处理有部分激活现象，但随着压力升高和持压时间的延长，树莓PPO的活性逐渐降低，600MPa，45min处理后树莓PPO残存活性为40.976%。与其它来源的PPO相比，树莓PPO的耐压敏感性较低。高静压钝化树莓PPO的过程符合一级动力学模型，R2＞0.900。随着压力升高和持压时间的延长，k值不断升高，D值不断减小；动力学参数Zp和Va分别为917.431MPa和-6.020cm3/mol。

图3 高静压钝化树莓PPO的Zp值

图4 高静压钝化树莓PPO的Va值

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Kinetic study of high hydrostatic pressure processing on polyphenol oxidase from raspberry

JIANG Jun，ZHANG Yan*，LIAO Xiao-jun，HU Xiao-song，SUN Zhi-jian
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

High hydrostatic pressure technique（HHP）was used to inactivate the polyphenol oxidase（PPO）of raspberry for making raspberry products fresher and raising their added value.The inactivation kinetics of polyphenol oxidase（PPO）under HHP was investigated.The results showed that the activity of raspberry PPO gradually decreased with the pressure increasing and/or the holding time extending，in spite that the PPO was activated under low pressure for short holding time.Residual activity of PPO was 40.976%treated by 600MPa for 45 minutes.Further，the inactivation of PPO under HHP can be adequately described by the first-order model，and the effect of pressure on the inactivation of PPO can be analyzed with Eyring equation.With the pressure increasing，the PPO inactivation rate constants k increased and the decimal reduction time D reduced.The Zpand Vawere 917. 431MPa and-6.020cm3/mol respectively.

high hydrostatic pressure；raspberry；polyphenol oxidase；kinetic

TS255.1

A

1002-0306（2010）11-0127-04

2009-09-11 *通讯联系人

江俊（1982-），女，硕士，研究方向：食品非热加工技术。

国家“863”计划重点课题（2007AA100405）。