混合发酵生产馒头菌种的筛选

胡丽花，苏东民，苏东海，辛秀兰

（1.河南工业大学，河南郑州450052；2.北京电子科技职业学院，北京100029）

混合发酵生产馒头菌种的筛选

胡丽花1，苏东民1，苏东海2，*，辛秀兰2

（1.河南工业大学，河南郑州450052；2.北京电子科技职业学院，北京100029）

传统馒头制作属于自然杂菌混合发酵，传统发酵使其具有独特风味。本研究主要是从传统的馒头发酵剂中筛选性能优良，适于馒头混合发酵的酵母菌和乳酸菌。通过对采集到的14个样品中的微生物进行分离、筛选、复筛，筛得性能较好的酵母菌和乳酸菌各15株，酵母菌中尤以Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4和JZ1-4的发酵性能最好。最后挑选酵母菌Sq4-3与5株代表性乳酸菌进行馒头混合发酵实验，结果表明不同乳酸菌对馒头品质的影响不同，其中添加Sq2.2的酸面团发酵的馒头总体感官评分最高，为7.56分。

乳酸菌，酵母菌，筛选，馒头

自从面包酵母被发明和使用以来，因其方便性而逐渐取代了传统面食发酵剂。传统面食发酵剂的使用虽然存在缺陷，但其混合菌种发酵使成品具有独特风味或特殊功能［1］。近年来国外对传统发酵剂酸面团的研究表明：酸面团的微生物为酵母菌和乳酸菌，应用酸面团能够改善面包的风味和质构，增加营养价值，延长货架期等［2］。我国传统主食发酵剂资源丰富，很有必要对我国传统主食发酵剂进行系统研究。本文的目的是根据菌种的形态特征、生化特性从采集到的传统馒头发酵剂中分离、筛选出性能优良且适于混合发酵馒头的酵母菌和乳酸菌。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

样品 河南省商丘和焦作的14个酵子样品；小麦粉 北京大磨坊面粉有限公司；培养基 综合马铃薯培养基、麦芽汁培养基、MRS培养基。

LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；Model 9960A Ultrasonic cleaners CBL photoelectron TECHNOLOGY；超净工作台 北京昌平长城空气净化工程公司；HPS-250生化培养箱 哈尔滨市东明医疗仪器厂；WJ-160A-Ⅱ二氧化碳细胞培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；3K15高速离心机 Sigma。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采集 从河南省商丘市采集11个样品标号为Sq1～11；来自河南省焦作孟州得3个样品编号为JZ1～3。将样品装入无菌瓶中，0～4℃保存。

1.2.2 微生物计数 各取样品1g分别加入到99mL无菌水中，超声波振荡20min，用无菌移液管准确吸取上清液1mL，加无菌水9mL进行稀释，10倍等梯度稀释法至10-7，分别取10-4，10-5，10-6，10-7浓度梯度稀释液各0.1mL，分别涂布于综合马铃薯培养基、麦芽汁琼脂和MRS培养基平板，每个梯度做2个平行，于28、28、30℃倒置培养72h，进行计数［3］。

1.2.3 菌种分离和筛选

1.2.3.1 酵母菌的分离和筛选 酵母菌的分离与筛选用含0.5g/L氯霉素的麦芽汁琼脂培养基，从菌落特征明显的单菌落上挑起少许移植于斜面培养基，于28℃恒温培养72h，进行第1次纯化。挑取纯化后的菌落少许划线接种于分离培养基，28℃恒温培养72h，进行第2次分离。按照第1次纯化操作进行第2次纯化，镜检。将采用连续划线分离纯化的菌种用麦芽汁琼脂斜面4℃保藏［3］。

1.2.3.2 乳酸菌的分离和筛选 每一样品系列稀释度的菌悬液接种于MRS琼脂平板，由MRS琼脂培养基的自动筛选进行分离。MRS琼脂培养基，添加还原剂（L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，W/V），灭过菌后倾注平板前加入无菌放线菌酮稀释液（0.01%，W/V）抑制酵母菌的生长［4-5］，5%CO2，30℃，培养72h［6］。分离菌株根据以下筛选标准确定：形态观察、革兰氏反应、过氧化氢酶反应，同型或异型发酵，15～45℃的生长情况。杆菌或球菌、革兰氏阳性（紫）、过氧化氢酶阴性（无气泡）为乳酸菌［5］。

1.2.4 菌种的复筛

1.2.4.1 酵母菌的复筛 发酵性能：采用杜氏管发酵法，将分离纯化后的酵母菌接种于麦芽汁培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养24h，测定酵母菌株产气泡的快慢、在规定时间内产气泡的多少及产生气味的浓度和类型，初步比较各株酵母菌的起酵能力、发酵能力及产香能力，初筛出性能优良的酵母菌［3］。菌株特性：进行耐酸能力实验，将酵母接入麦芽汁培养基中，将麦芽汁培养基的pH用1mol/L的H2SO4调pH分别为3.2、4.2、5.2和6.2；灭菌后，按2%接种量接入活化好的酵母菌，28℃培养10h，于波长660nm处测OD值，确定其耐酸能力［3］。

1.2.4.2 乳酸菌的复筛 乳酸菌产酸、产味实验：向含有5%面粉的无菌溶液中接入1%过夜培养的乳酸菌培养液，30℃培养24h，用pH计测酸度［5］，同时检查其产味情况。

1.2.5 混合发酵实验

1.2.5.1 菌种和老面团制备 取新鲜培养酵母菌种和乳酸菌的斜面菌种一环，分别接种到装有20mL无菌麦芽汁和MRS液体培养基，28℃和30℃培养24h。然后接种到装有100mL上述培养基的三角瓶，同上培养24h后，于4℃、5000×g离心15min，除去上清液，获得微生物的细胞溶于无菌生理盐水，用于馒头实验。

2000mL大烧杯中600g水，400g面粉混合，LAB和/或酵母的接种量为 105～106cfu/g，24℃，发酵12h［7］。

1.2.5.2 发酵馒头及评价 采用软式主食馒头发酵方法：按面团的20%添加酸面团，同时添加面包酵母0.5%［7-8］。50g酸面团，20mL水，0.5g燕子牌即发干酵母，70g馒头专用粉，用手混匀后，形成光滑完整的面团。将面团置于温度为32±2℃、相对湿度为85%的醒发箱中发酵40min。取出添加10g面粉揉成半圆型面团，同以上发酵条件醒发20min。采用Φ33cm的不锈钢锅，加入1800mL水，加热至沸腾后将馒头坯放在蒸箅上，盖严，沸水汽蒸20min，停火2min后，取出馒头。20min后对其体积、外表状况、内部组织结构、香味、口感进行感官评价［9］。

2 结果与讨论

2.1 微生物计数

由于地理位置及存储时间的不同，不同样品的活菌数不同，酵母菌的活菌数106～109cfu/g不等，乳酸菌的活菌数为105～108cfu/g。

2.2 酵母菌和乳酸菌的初步分离和筛选结果

主要根据菌株的外形特征及生化特性对14个样品中的微生物进行初步分离和筛选，分别挑选出菌落特征明显且生长良好的酵母菌和乳酸菌单菌落分别为56个和67个。一般形态特征为细胞呈球形、卵圆形或椭圆形，单细胞，有核，无鞭毛；菌落呈圆形或椭圆形，凸起，表面光滑湿润的为酵母菌。杆菌或球菌、革兰氏阳性（紫）、过氧化氢酶阴性（无气泡）的为乳酸菌。酵母菌和乳酸菌分别进行美兰染色，革兰氏染色后进行显微镜观察的照片如图1、图2所示。

图1 酵母菌

图2 乳酸菌

传统主食发酵剂属于自然杂菌混合发酵，其主要优势菌群为酵母菌和乳酸菌，酵母菌起发酵面团作用，乳酸菌酸化面团从而影响面团及终产品的特性。丁长河等［4］曾对传统起子-酵头中的微生物进行分析，根据碳水化合物的发酵和吸收从12个传统酵头样品中分离出4种细菌和3种酵母菌，经生物梅里埃的Vitek-32系统自动鉴定，分离得到的3株酵母菌都为酿酒酵母，3株细菌分别为蜡样芽孢杆菌、鲁氏不动杆菌和短小芽孢杆菌。Hulya Gul等［5］从面包酸面团中筛选的酵母菌为Saccharomyces cerevisiae，S.delbrueckii，Torulopsis holmii and T.unisporus；乳酸菌有Lactobacillus divergens，Lactobacillus brevis，Lactobacillus amylophilus，Lactobacillus sake， Lactobacillus acetotolerans，Lactobacillus plantarum， Pediococcus pentosaceus，P.acidilactici和Tetragenococcus halophilus。

2.3 复筛

本研究的目的是从传统的馒头发酵剂中筛选性能优良的酵母菌和乳酸菌，并且适于纯菌接种混合发酵生产具有特殊风味或特定功能馒头的菌种。在面团发酵过程中酵母菌起发酵面团的作用，在混合发酵过程中，乳酸菌会产酸使面团的pH降低。所以对酵母菌主要根据其发酵性能、耐酸能力来进行复筛，经复筛挑选出15株，其编号及筛选结果如表1，尤其Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4、JZ1-4的性能较好。

表1 酵母菌的分离与筛选

表2 乳酸菌的分离与筛选

表3 菌种组合及评价结果

酵母菌和乳酸菌混合发酵过程中，若乳酸菌产酸能力太强，pH太低不仅会抑制酵母菌的生长，进而影响面团发酵性能，而且酸味过重影响产品风味，导致终产品不被消费者所接受。同时考虑到乳酸菌起影响风味的作用，所以乳酸菌复筛过程中主要根据其产酸产味特性筛出15株，其编号及筛选结果如表2。

2.4 混合发酵

筛选性能优良的酵母菌和乳酸菌是首要任务，但纯菌接种混合发酵是今后研究的方向和重点。基于这一要求，挑选出一株优良的酵母菌和5株产酸能力不同的代表性乳酸菌进行馒头混合发酵实验，菌种组合及评价结果见表3。

由表3可以看出，添加乳酸菌的酸面团发酵的馒头其感官总体评分要比只添加酵母菌的要高，而不同乳酸菌与酵母菌混合发酵对馒头品质的影响也不同，添加乳酸菌Sq2.2的酸面团发酵的馒头其总体感官评分最高为 7.56分，其次为 Sq3.1、Sq6.3和Sq4.5。

3 结论

根据菌株的外形特征及生化特性进行初步分离和筛选，再结合面团发酵过程中酵母菌和乳酸菌各自起的作用确定复筛标准经过复筛，其中酵母菌中Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4和JZ1-4的发酵性能较好。最后挑选酵母菌Sq4-3与5株代表性乳酸菌进行混合发酵实验，发现不同乳酸菌与酵母菌混合发酵对馒头品质的影响也不同，其中添加乳酸菌Sq2.2的酸面团发酵的馒头总体感官评分最高为7.56分，其次为Sq3.1、Sq6.3和Sq4.5。

［1］杨敬雨，刘长虹.中国传统酵子的工业化［J］.食品研究与开发，2007，28（2）：164-166.

［2］Rehman S，Paterson A，R.piggott J.Flavour in sourdough breads：a review［J］.Trends in Food Scienceamp;Technology，2006，（17）：557-566.

［3］苏东海.馒头酵母的分离与筛选［J］.农产品加工，2008（7）：82-84.

［4］丁长河，戚光册，张建华，等.传统起子（酵头）的微生物分析及其对馒头品质的影响［J］.食品科学，2007，28（4）：69-74.

［5］Gul H，Qzcelik S，Saodic O，et al.Sourdough bread production with lactobacilli and S.cerevisiae isolated from sourdoughs［J］. Process Biochemistry，2005，40：691-697.

［6］Haggman M，Salovaara H.Microbial re-inoculation reveals differences in the leavening power of Sourdough yeasts trains［J］. LWT，2008，41：14-154.

［7］Katina K，Heinio R.-L，Autio K，et al.Optimization of sourdough process for improved sensory profile and texture of wheat bread［J］.LWT，2006，39：1189-1202.

［8］Paramithiotis S，Chouliaras Y，Tsakalidou E，et al.Application of selected starter cultures for the production of wheat sourdough bread using a traditional three-stage procedure［J］.Process Biochemistry，2005，40：2813-2819.

［9］苏东民.中国馒头分类及主食馒头品质评价研究［D］.北京：中国农业大学，2005.

Screening strains for co-fermenting Mantou

HU Li-hua1，SU Dong-min1，SU Dong-hai2，*，XIN Xiu-lan2
（1.College of Grain and Food，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China；2.Biology Department，Beijing Vocational College of Electronic Science，Beijing 100029，China）

Traditional Mantou was fermented by natural mixed starter cultures with unique flavor.ln this study，the purpose is to screen lactic acid bacterias and yeasts from traditional starter cultures of Mantou，which have fine performance and are appropriate to co-ferment Mantou.The microorganisms of 15 LABs and 15 yeasts were obained from 14 samples through separating，screening and re-screening，especially the best strains were Sq4-3，Sq7-2，Sq9-2，Sq9-4 and JZ1-4 among yeasts.Eventually Sq4-3 and 5 representative strains among lactic acid bacterias were chosen to co-ferment Mantou.The results showed that different LAB had different effect on quality of Mantou.Mantou fermented by sourdough adding Sq2.2 have the highest score for the overall sense 7.56 points.

lactic acid bacteria；yeast；screen；Mantou

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-203-04

2009-08-28 *通讯联系人

胡丽花（1983-），女，硕士研究生，研究方向：传统食品的工业化。

北京市自然科学基金资助项目（5093026）；北京市教委科技计划面上项目（KM200900002003）。