桉叶油毒性及其对环磷酰胺致小鼠骨髓微核及精子畸形的保护作用

余永莉，王传铜，冯国纹，唐于川，赵晟珣，王 霞，兰美兵，李啸红

(遵义医学院珠海校区人体解剖与组织胚胎教研室，广东珠海 519041)

环磷酰胺(cyclophosphamide，CP)是临床上常用的氮芥类的抗肿瘤药物，进入人体后在肝脏或血液中经活化生成烷基化的代谢产物，进而发挥抗肿瘤的作用，其主要的不良反应是严重损伤骨髓细胞的造血功能，引起白细胞减少以及导致感染等严重后果，影响治疗效果。同时它也是一种诱变剂 ，可明显诱发骨髓细胞微核和姐妹染色单体互换，动物实验中它常用作研究遗传毒性和生殖毒性实验阳性对照组模型的造模剂。因此，寻找对于CP所致损伤具有防护作用的物质，对于临床上减轻使用CP进行治疗的患者的不良反应具有重要意义。对于保护职业性接触这种化学物质的人群也有一定意义。

桉叶是民间常用的草药。桉叶可提取桉叶油(eucalyptus)，主要化学成分是萜类、萜醇、醚、酮类和酯等含氧化合物［1］，气味芳香，具有挥发性。是医药、香料和化学工业的重要原料，也是常用的食品添加剂。其药理作用有抗菌［2－4］、抗氧化［5－8］、抗炎［9］、促渗［10－11］、杀虫驱蚊［12－15］及防腐。随着桉叶油在抑菌杀虫方面的研究和应用越来越深入，对于桉叶油的生物活性机制研究也引起了普遍重视。本研究用桉叶油ig给予小鼠，研究桉叶油的遗传毒性及其对CP所致小鼠的遗传毒性是否有保护作用，为其作为食品添加剂、香料利用，或药品开发提供一些遗传毒性方面的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠购自广东省医学实验动物中心，合格证号:SCXK(粤)2007-0002。饲养条件:室温为24～27℃，通风，相对湿度为68% ～80%，每日光照12 h，自由摄食饮水。

1.2 药品及试剂

桉叶油(桉叶素99.5%)购自德信行(珠海)香精香料有限公司，批号H071126。CP购自山西普德药业有限公司，批号08061521。

1.3 急性毒性实验

1.3.1 测定桉叶油对小鼠的半数致死量

小鼠50只，体重18～23 g，随机分成5组，雌雄各半。根据预实验设计各组小鼠分别ig给予桉叶油1700，1750，1800，1850 和1900 mg·kg－1。观察并记录2周动物的死亡情况。利用SPSS13.0计算LD50和95%的可信区间。

1.3.2 骨髓微核实验测定桉叶油对小鼠微核率的影响

另取小鼠50只，体重18～23 g，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。其中，桉叶油400，200和100 mg·kg－1组，以及溶剂对照组(花生油0.4 ml)和阳性对照组(CP)。桉叶油组小鼠每天ig给予1次，连续5 d。阳性对照组于处死前2 d开始ip给予CP 40 mg·kg－1，每天1次。各组于末次用药2 h后脱颈椎处死，每只小鼠取其两侧股骨骨髓，按李啸红等［16］实验方法制片。细胞涂片置显微镜油镜下观察，每只小鼠骨髓涂片计数1000个骨髓嗜多染红细胞，微核率以含微核的嗜多染红细胞数的千分率计。每组微核率比值采用单因素方差分析，SPSS13.0软件进行统计处理。

1.3.3 精子畸形实验测定桉叶油对小鼠精子畸形率的影响

昆明种小鼠，雄性30只，20～25 g，随机分为5组，每组6只。各组用药剂量同微核实验。受试药物组及阴性对照组小鼠每天ig给予1次，阳性对照组ip给予CP 40 mg·kg－1，每天1 次，连续5 d。各组小鼠于第一次给药后35 d，脱颈椎处死，取出其双侧附睾放入盛有生理盐水的离心管中，按胡怡秀等［17］方法制片、镜检。每只小鼠观察1000个精子，记录畸形(镰刀形、双尾、胖头、无钩和无定形等)数目并统计畸形率(‰)。

1.4 桉叶油的保护作用

1.4.1 小鼠骨髓微核率的测定

小鼠50只，雌雄各半，18～23 g，随机分成5组，每组10只。其中桉叶油100，200和400 mg·kg－1组，花生油(溶剂对照)0.4 ml和 CP 40 mg·kg－1(阳性对照)组。桉叶油组与溶剂对照组小鼠每天上午9时ig给药，连续5 d，在处死前2 d各组与阳性对照组一起ip给予CP 40 mg·kg－1，每天1次。第5天末次给药2 h后脱颈椎处死小鼠取骨髓细胞涂片，进行骨髓嗜多染红细胞中的微核计数。

1.4.2 小鼠精子畸形率的测定

雄性昆明种小鼠，30只，体重20～25 g，随机分为5组，每组6只。各组用药剂量同1.4.1。桉叶油组及溶剂对照组小鼠每天ig 1次，连续10 d，第6天起与阳性对照组一起每天ip给予CP 1次，连续5 d。各组小鼠于第一次注射CP后35 d，脱颈椎处死，取精子观察精子畸形率。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 桉叶油急性毒性

小鼠ig给予桉叶油后，小鼠精神萎靡，活动量少，饮食量少。但桉叶油≤1800 mg·kg－1组2～3 d后活动、饮食恢复常态。小鼠ig给予桉叶油1700～1900 mg·kg－1后，桉叶油的 LD50为 1824.01 mg·kg－1，95%可信限为 1799.48 ～1851.19 mg·kg－1。

小鼠ig给予桉叶油400，200和100 mg·kg－15 d后，骨髓嗜多染红细胞中的微核率分别为0，(0.1 ±0.3)‰，(0.2 ±0.6)‰，与溶剂对照组比较无显著差异，但明显低于阳性对照组(17.8±4.6)‰(P＜0.05)，提示桉叶油对小鼠骨髓嗜多染红细胞数微核率无明显影响。

雄小鼠 ig给予桉叶油 400，200 和 100 mg·kg－15 d后，精子畸变率分别为(3.7 ±1.6)‰，(3.5 ±1.5)‰和(6.5 ±2.5)‰，与溶剂对照组(6.8 ±2.8)‰比较无显著性差异，但明显低于CP(阳性对照)组精子畸变率(67±26.4)‰(P ＜0.05)，提示桉叶油对小鼠精子畸形无明显影响。

2.2 桉叶油对环磷酰胺致小鼠骨髓微核率及精子畸形率的影响

小鼠预先ig给予桉叶油100，200 和400 mg·kg－1，CP诱发小鼠的骨髓嗜多染红细胞中的微核率分别为(10.7 ±4.1)‰，(7.3 ±4.3)‰，(9.0 ±2.6)‰，明显低于阳性对照CP诱发的微核率(18.5±5.6)‰(P＜0.05)，但花生油(溶剂组)(17.5 ±3.3)‰无此作用(表1)，提示桉叶油可降低CP诱发的小鼠骨髓微核率，花生油无此作用。

表1 桉叶油对环磷酰胺诱发骨髓嗜多染细胞微核率的影响Tab.1 Effect of eucalyptus on micronucleus of bone narrow induced by cyclophosphamide in mice

小鼠 ig给予桉叶油400，200和100 mg·kg－110 d后，CP诱发小鼠精子畸形率分别为(37.2±22.7)‰，(31.3 ±24.3)‰和(46 ±14.9)‰，明显低于阳性对照CP所致小鼠精子畸形率(67±26.37)‰(P ＜0.05)，但 ig 给予花生油(17.5 ±3.3)‰无此作用(表2)。提示桉叶油可降低CP致小鼠精子畸形率，花生油无此作用。

表2 桉叶油对环磷酰胺诱发精子畸形率的影响Tab.2 Effect of eucalyptus on sperm malformation rate induced by cyclophosphamide in mice

3 讨论

桉叶油可以抑制炎症早期血管通透性的增强，渗出和水肿，抑制前列腺素(PG)合成、释放或其致炎作用，阻止组胺从 RBL-2H3细胞中释放、消除氧自由基改善炎症症状。通过激活红细胞中的过氧化氢酶起到抗过氧化作用［18－19］。

随着桉叶油研究的不断深入，其应用也越来越广泛，医药用桉叶油主要以富含1，8-桉叶油素的精油为主 ，分离提纯1，8-桉叶油素可以治疗流感 、感冒、细菌性痢疾和肠炎等各种感染。在口腔医学中可用作口腔清洁剂的除臭组分。1，8-桉叶油素还有抑制食欲的作用，用它配制的水剂和药片，对治疗食欲亢进和减肥，有很好的效果［19－20］。桉叶油在食品中最高参考量为软饮料含 1.7 mg·kg－1;冷饮含0.5～50 mg·kg－1;酒类含1.0 mg·kg－1;焙烤食品含76 mg·kg－1。本实验采取桉叶油100，200 和 400 mg·kg－1的剂量，均大于规定的范围。且本研究结果显示，桉叶油400 mg·kg－1ig给予小鼠5 d，小鼠的骨髓嗜多染红细胞微核率和精子畸形率与溶剂对照组比较无明显的差异，在预实验中桉叶油400 mg·kg－1ig给予成年小鼠2周，小鼠的骨髓嗜多染红细胞微核率和精子畸形率与溶剂对照组比较也无明显的差异，提示桉叶油无诱发微核和精子畸形的遗传毒性。但预先给予桉叶油的小鼠对CP所致的骨髓嗜多染红细胞微核率和精子畸形率较未服用桉叶油组有明显下降(P＜0.05)。提示桉叶油具有拮抗CP诱发的骨髓嗜多染红细胞微核率和精子畸形率升高的作用。桉叶油的这一作用对降低临床用CP化疗患者的药物副作用的影响，具有一定的意义，而其确切的作用机制，尚有待进一步研究。

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