镧对大鼠海马CA1区环磷酸腺苷应答元件结合蛋白磷酸化的影响

杨敬华，巫生文，刘秋芳，张立丰，齐 鸣，鲁 帅，蔡 原

(中国医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，辽宁沈阳 110001)

近十几年来，稀土元素在我国的应用涉及农业、畜牧业和水产养殖等多个领域，越来越多的稀土元素进入环境，并通过食物链进入人体。稀土元素对生物体具有毒物兴奋效应作用，即低水平的稀土元素能促进机体的生长，而高水平的稀土元素对机体具有毒性作用［1］。人群调查显示，稀土矿区儿童的智商均数和学习记忆等认知能力明显低下［2］。镧属于自然界中含量较多的轻稀土元素。动物实验显示，镧可以影响神经行为发育以及学习记忆能力［3－4］，但其机制仍未完全阐明。海马是脑内与学习记忆有关的重要结构，即刻早期基因c-fos和c-jun与学习记忆关系密切［5］。本实验室前期的研究已发现，镧损害学习记忆的机制与海马CA1区c-fos表达水平降低有关［6］。cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是诱导即刻早期基因转录的关键性因素，在学习记忆中发挥重要作用［7］。CREB的Ser133位点磷酸化是其活化形式，钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(calmodulin dependent protein kinaseⅣ，CaMKⅣ)是磷酸化CREB Ser133位点的重要蛋白激酶［8］。因此，观察氯化镧(lanthanum chloride，LaCl3)对大鼠海马CA1区CaM活性和CaMKⅣ，CREB磷酸化以及c-jun基因转录和蛋白表达的影响，研究镧的毒性及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

LaCl3，分析纯(国药沈阳化学试剂有限公司)，蛋白定量试剂盒(普利来基因技术有限公司)，RTPCR试剂盒(TaKaRa BIO)，磷酸二酯酶，环磷腺苷和蝮蛇蛇毒(Sigma)，兔抗大鼠p-CaMKⅣ抗体，兔抗大鼠p-CREB抗体，兔抗大鼠c-jun抗体和兔抗大鼠GAPDH抗体(Santa Cruz)。

1.2 仪器

GRADIENT96型PCR仪(德国，Biometra公司)、X-7电感耦合等离子体质谱仪(美国，Thermo Elemental公司)、CS150GXL型低温高速离心机(日本，Hitachi公司)、JY96-IIN型超声波细胞破碎机(中国，宁波新芝生物科技股份有限公司)、HH42型快速恒温数显水箱(中国，常州国华电器有限公司)、PAC300水平电泳仪(美国，Bio-Rad Power公司)、DYY-6B型垂直电泳仪(中国，北京六一仪器厂)和IMAGER5500凝胶图像分析系统(美国，Alpha公司)。

1.3 动物分组与染毒

清洁级 Wistar大鼠〔证号:SYXK(辽)，2003-0013〕由中国医科大学实验动物中心提供，60只，体重250～270 g，雌雄比例2∶1。正式实验前饲养7 d，实验动物室温度17～23℃，相应湿度45% ～55%，动物饲料由实验动物中心提供。将40只雌性Wistar大鼠随机分为对照组、LaCl30.25%、0.5% 和1.0%染毒组，然后将雌性大鼠与雄性大鼠按2∶1同笼进行交配，次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者定为受孕，记为妊娠第0天。对照组孕鼠饮用蒸馏水。镧染毒组仔鼠在断乳前经由吸吮母乳染镧，断乳后则通过自行饮用LaCl30.25%，0.5%和1.0%蒸馏水溶液染镧1个月，然后进行各项指标测定。每项指标均从每组随机取8只仔鼠进行检测。

1.4 电感耦合等离子体质谱法［9］检测仔鼠海马CA1区镧含量

仔鼠麻醉后，用生理盐水全身灌流以消除血液的影响。取海马CA1区组织，置于特氟纶(Teflon)管内，加入65%硝酸2 ml和H2O21 ml，用特氟纶塞密封后置于钢罐中。钢罐密封后在180℃加热4 h以消化海马组织样品，然后用2%(V/V)硝酸稀释已消化的组织样品至10 ml，采用电感耦合等离子体质谱仪测定海马CA1区组织样品中的镧含量。仪器工作参数:入射功率:1200 W;反向功率:3 W;雾化气流速:0.78 L·min－1;辅助气流速:0.70 L·min－1;冷却气流速:13.0 L·min－1;样品提升量:1.2 ml·min－1;质量采集方式:脉冲;数据采集方式:跳峰;停留时间:10 ms;扫描次数:50;分辨率:l25;每个质量通道数:3。在上述工作条件下，镧标准系列溶液和组织样品液依次进入ICP-MS后，以镧标准溶液浓度和对应信号值，绘制标准曲线，在标准曲线上查出组织样品液中镧浓度。然后按下式计算镧含量:组织样品中镧含量(μg·g－1组织)=组织样品液镧浓度(mg·L－1)×组织样品液总体积(ml)×组织样品的质量(g)－1。

1.5 磷酸二酯酶法［10］检测仔鼠海马CA1区CaM活性

取海马CA1区组织，充分匀浆，超声波破碎细胞，20 000×g离心15 min，取上清，加入含PDE的反应缓冲液，再加入20 mmol·L－1的环磷腺苷以启动反应，转入30℃水浴下反应30 min。反应到时后转移至沸水浴中终止反应，然后立即移至冰浴中冷却，再加入蝮蛇蛇毒1 g·L－1，于30℃水浴中反应，加入55%TCA终止反应。以20 000×g离心15 min，取上清液，加入定磷试剂，在850 nm处测定吸光度值(A)。以KH2PO4标准系列溶液浓度和对应A值，绘制标准曲线，在标准曲线上查出组织样品液中磷浓度。CaM的1个活性单位(U)是指在上述反应条件下，每分钟由底物生成1μmol磷。按下式计算CaM活性:组织样品中CaM活性(U·g－1蛋白)=样品液磷浓度(mmol·L－1)×样品液总体积(ml)×组织蛋白含量(g)－1×时间(min)－1。

1.6 Western印迹法检测仔鼠海马 CA1区p-CaMKIV，p-CREB和c-jun蛋白含量

取海马CA1区组织，提取蛋白，采用酚试剂法进行蛋白定量。取总量相同的蛋白，在10%SDS-聚丙烯酰胺中电泳，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，将膜于4℃、5%脱脂奶粉中封闭2 h，TTBS洗3次，兔抗大鼠 p-CaMKⅣ(1∶100)、p-CREB 抗体(1∶200)、c-jun 抗 体 (1∶200)或 GAPDH 抗 体(1∶1000)中4℃孵育过夜，TTBS洗3次，室温下二抗中孵育2 h。应用ECL显示反应产物，曝光，显影，定影。采用图像分析系统进行蛋白表达水平分析，兔抗GAPDH抗体作为内参校正上述蛋白的相对表达水平。积分吸光度 A(integrated absorbance，IA)表示海马中蛋白的表达水平。

1.7 RT-PCR法检测仔鼠海马 CA1区 c-jun mRNA水平

取海马CA1区组织，提取总RNA，进行RNA定量与纯度鉴定。用TaKaRa RT-PCR Kit(AMV)的二步法进行 RT-PCR。c-jun引物序列:上游5'-AGCAATGGGCACATCACC-3'，下游5'-TCTGCGGCTCTTCCTTCA-3'，PCR产物长度451 bp;β肌动蛋白引物序列:上游 5'-TTTTGTGCCTTGATAGTTCGC-3'，下游5'-GAGTCCTTCTGACCCATACCC-3'，PCR 产物长度264 bp。所得产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统进行灰度扫描，以c-jun条带灰度值与β肌动蛋白条带灰度值的比值表示c-jun mRNA的表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 镧染毒仔鼠海马CA1区镧含量

与正常对照组相比，各染毒组仔鼠海马CA1区镧含量显著增高(P＜0.05)，并与镧染毒剂量呈正相关，相关系数 r=0.989(P ＜0.05)(表1)。

表1 染毒仔鼠海马CA1区镧含量Tab.1 Lanthanum contents in the hippocampal CA1 area of rat pups after lanthanum exposure

2.2 镧对仔鼠海马CA1区钙调蛋白活性的影响

表2结果显示，与正常对照组相比，镧染毒使仔鼠海马CA1区钙调蛋白活性降低(P＜0.05)，并随着染毒剂量的增加而逐渐降低，LaCl30.25%，0.5%和1.0%染毒组仔鼠海马CA1区钙调蛋白活性分别降低至正常对照组的 80.7%，59.9%和 30.6%(P＜0.05)，说明镧染毒以剂量依赖性方式下调钙调蛋白活性。

表2 镧对仔鼠海马CA1区钙调蛋白(CaM)活性的影响Tab.2 Effect of lanthanum on calmodulin(CaM)activity in the hippocampal CA1 area of rat pups

2.3 镧对仔鼠海马CA1区p-CaMKⅣ蛋白表达的影响

图1结果显示，与正常对照组比，LaCl30.25%，0.5%和1.0%染毒使仔鼠海马CA1区p-CaMKⅣ蛋白表达降低，分别降低至正常对照水平的83.0%，57.4%和27.7%(P ＜0.05)，说明镧染毒以剂量依赖性方式下调p-CaMKⅣ蛋白表达水平。

图1 镧对仔鼠海马CA1区磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(pCaMKⅣ)蛋白表达的影响.动物处理见表1.1:正常对照组;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%组.±s，n=8.*P＜0.05，与正常对照组比较;△P ＜0.05，与 LaCl3 0.25% 组比较;#P ＜0.05，与 LaCl3 0.5%组比较.Fig.1 Effect of lanthanum on phosphorylated-calmodulin dependent protein kinaseⅣ(p-CaMKⅣ)in the hippocampal CA1 area of rat pups.

2.4 镧对仔鼠海马CA1区p-CREB蛋白表达的影响

图2 结果显示，与正常对照组比，LaCl30.25%，0.5%，1.0%染毒使仔鼠海马CA1区p-CREB蛋白表达降低，分别降低了 24.4%，36.6%和 73.2%(P＜0.05)，说明镧染毒与 p-CREB蛋白表达下降之间具有一定的剂量-反应关系。

图2 镧对仔鼠海马CA1区磷酸化环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(p-CREB)蛋白表达的影响.动物处理见表1.1:正常对照组;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%组.±s，n=8.*P＜0.05，与正常对照组比较;△P ＜0.05，与 LaCl3 0.25% 组比较;#P ＜0.05，与 LaCl3 0.5%组比较.Fig.2 Effect of lanthanum on phosphorylated-cAMP response element binding protein(p-CREB)in the hippocampal CA1 area of rat pups.

2.5 镧对仔鼠海马CA1区c-jun mRNA表达的影响

图3结果显示，与正常对照组比，LaCl30.25%，0.5%和1.0%染毒使仔鼠海马CA1区c-jun mRNA表达降低，分别降低了14.8%，27.2%和76.5%(P ＜0.05)，说明镧与 c-jun mRNA 表达下降之间具有一定的剂量-效应关系。

图3 镧对仔鼠海马CA1区c-jun mRNA表达的影响.动物处理见表1.1:正常对照组;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%组.x¯±s，n=8.*P＜0.05，与正常对照组比较;△P＜0.05，与LaCl3 0.25%组比较;#P ＜0.05，与 LaCl3 0.5%组比较.Fig.3 Effect of lanthanum on c-jun mRNA in the hippocampal CA1 area of rat pups.

2.6 镧对仔鼠海马CA1区c-jun蛋白表达的影响

图4 镧对仔鼠海马CA1区c-jun蛋白表达的影响.动物处理见表1.1:正常对照组;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%组.x¯±s，n=8.*P＜0.05，与正常对照组比较;△P＜0.05，与LaCl3 0.25%组比较;#P ＜0.05，与 LaCl3 0.5%组比较.Fig.4 Effect of lanthanum on c-jun protein in the hippocampal CA1 area of rat pups.

图4 结果显示，与正常对照组比，LaCl30.25%，0.5%，1.0%染毒使仔鼠海马CA1区c-jun蛋白表达降低，分别降低了36.1%，45.9%和83.6%(P ＜0.05)，说明镧染毒与c-jun蛋白表达下降之间具有一定的剂量-反应关系。

3 讨论

有研究表明，REEs可进入脑组织，并在脑组织内长期蓄积，其中镧在脑组织中的蓄积性较强［11］。Feng等［12］在大鼠4周 ～6月龄期间 ig给予 LaCl30.1，2 和 40 mg·kg－1染毒，结果发现 LaCl340 mg·kg－1染毒组大鼠的脑组织内明显蓄积，大脑皮质、海马和小脑中镧含量分别达到0.039，0.014和0.015μg·g－1组织。本研究显示，出生后至断乳后 1个月期间LaCl3暴露造成镧在大鼠海马CA1区明显蓄积，镧在海马CA1区的蓄积量与染镧剂量呈明显正相关。任丽宝等［13］对镧在大鼠脑组织中吸收规律和蓄积特点的研究结果也显示，大鼠脑组织中镧含量随其摄入量增加而逐渐增高，存在一定的量效关系。海马是脑内与学习记忆有关的重要结构和关键部位，海马包括CA1，CA2和CA3区和齿状回区域，其中CA1区和学习记忆关系更为密切。因此，本研究中LaCl3大于0.25%暴露造成镧在海马CA1区蓄积，这可能是LaCl3影响中枢神经系统(尤其是海马)结构和功能的基础。

CaM是一个广泛存在于真核细胞生物中的多功能蛋白，它广泛分布于脑组织中。CaM在细胞内有两种存在形式，一种是非活性CaM，以游离状态存在于细胞的胞浆里;一种是活性CaM，与Ca2+和酶/蛋白结合。当CaM与Ca2+结合时，形成Ca2+-CaM复合物，CaM构象发生改变，暴露出肽链表面的疏水基团，保证CaM与靶酶/蛋白的结合完全匹配［14］。CaM在Ca2+参与的细胞信号转导过程中起关键作用，而且CaM直接参与长时程增强的形成［15］。在本研究中，染镧造成仔鼠海马 CA1区CaM活性显著降低，可见染镧造成仔鼠海马中具有生物活性的CaM水平下降，其原因可能是由于CaM是细胞内La3+作用的靶点之一，La3+与Ca2+竞争结合于CaM，La3+与CaM的结合力强于Ca2+与CaM的结合力，影响 Ca2+与 CaM 的正常结合［16－18］，从而造成海马中具有生物活性的CaM水平降低。随着LaCl3染毒剂量的增加，仔鼠海马CaM活性进一步下降，其原因可能是更多的La3+与Ca2+竞争结合于CaM，造成具有生物活性的CaM水平进一步降低。

CaMK包括 CaMKⅠ，CaMKⅡ，CaMKⅢ和CaMKⅣ，其活化有赖于CaM。其中CaMKⅣ又称做CaMK Gr，主要在神经元的细胞核中表达，它是磷酸化转录因子CREB的重要蛋白激酶，在突触可塑性、学习记忆过程中发挥重要作用［19］。磷酸化对于CaMKⅣ的激活是必需的，即磷酸化的CaMKⅣ是其活化形式。在本研究中，染镧组仔鼠海马CA1区p-CaMKⅣ蛋白表达水平显著低于对照水平，可见在LaCl3的作用下，由于仔鼠海马CA1区CaM活性显著降低，激活CaMKⅣ的能力下降，造成仔鼠海马CA1区活化的CaMKⅣ(即p-CaMKⅣ)表达水平显著减少，CaMKⅣ的生物学作用受到削弱。

CREB属于含亮氨酸拉链的转录因子家族成员，是细胞内多种信号通路的一种关键成分，具有调节包括学习记忆在内的广泛的生物学功能。研究表明，CREB依赖性转录是学习记忆和可塑性形成过程所必需的［20］。在本研究中，镧染毒组仔鼠海马CA1区p-CREB的表达水平显著低于对照水平，可见染镧造成仔鼠海马CA1区CREB的磷酸化水平显著下降。c-jun基因是即刻早期基因家族成员，CREB的Ser133位点磷酸化是触发c-jun转录的关键所在。研究显示，c-jun与c-fos基因的表达产物结合成复合物，作用于异源二聚体激活蛋白-1结合位点，激活编码突触成分、影响突触传递的基因，从而较长时间地改变神经元的结构和功能，影响突触可塑性［21－22］。本研究显示，镧染毒组仔鼠海马CA1区c-jun mRNA和蛋白表达水平明显低于正常对照组水平，c-jun蛋白表达水平的变化趋势与其基因转录水平的变化一致，而且海马CA1区c-jun mRNA和蛋白表达水平和染毒剂量之间具有一定的剂量-效应关系，说明镧染毒造成海马CA1区c-jun基因转录和蛋白表达水平降低，损害突触可塑性，因而损害大鼠的学习记忆能力。

本研究表明镧损害学习记忆能力的机制可能与镧造成海马CA1区CaM活性和CaMKⅣ、CREB磷酸化以及c-jun基因转录和蛋白表达水平下降有关，但镧损害学习记忆能力的确切机制尚需进一步探讨。

［1］徐厚恩.中国资源环境与健康研究进展［M］.北京:北京医科大学出版社，2004:43-64.

［2］范广勤，袁兆康，郑辉列，刘志刚.儿童稀土暴露的健康效应研究［J］.卫生研究，2004，33(1):23-28.

［3］Feng L，Xiao H，He X，Li Z，Li F，Liu N，et al.Long-term effects of lanthanum intake on the neurobehavioral development of the rat［J］. Neurotoxicol Teratol，2006，28(1):119-124.

［4］He X，Zhang Z，Zhang H，Zhao Y，Chai Z.Neurotoxicological evaluation of long-term lanthanum chloride exposure in rats［J］.Toxicol Sci，2008，103(2):354-361.

［5］Dong J，Yin H，Liu W，Wang P，Jiang Y，Chen J.Congenital iodine deficiency and hypothyroidism impair LTP and decrease C-fos and C-jun expression in rat hippocampus［J］.Neurotoxicology，2005，26(3):417-426.

［6］杨敬华 ，蔡 原，刘秋芳，张立丰，齐 鸣，巫生文，等.镧影响大鼠学习记忆及海马c-fos基因、CA1区c-Fos蛋白表达的研究［J］.毒理学杂志，2009，23(1):15-18.

［7］Mizuno M，Yamada K，Maekawa N，Saito K，Seishima M，Nabeshima T.CREB phosphorylation as a molecular marker of memory processing in the hippocampus for spatial learning［J］.Behav Brain Res，2002，133(2):135－141.

［8］Ho N，Liauw JA，Blaeser F，Wei F，Hanissian S，Muglia LM，et al.Impaired synaptic plasticity and cAMPresponse element-binding protein activation in Ca2+/calmodulindependent protein kinase typeⅣ/Gr-deficient mice［J］.J Neurosci，2000，20(17):6459-6472.

［9］Gélinas Y，Lafond J，Schmit JP.Multielemental analysis of human fetal tissues using inductively coupled plasma-mass spectrometry［J］.Biol Trace Elem Res，1997，59(1-3):63-74.

［10］黄号栋，杨 静，龚 明.用磷酸二酯酶定量检测植物钙调素方法的改进［J］.植物生理学通讯，2003，39(2):156-160.

［11］陈祖义.稀土元素的脑部蓄积性、毒性及其对人群健康的潜在危害［J］.农村生态环境，2005，21(4):72-73，80.

［12］Feng L，Xiao H，He X，Li Z，Li F，Liu N，et al.Neurotoxicological consequence of long-term exposure to lanthanum［J］.Toxicol Lett，2006，165(2):112-120.

［13］任丽宝，王小燕，解 清，刘景秀，黄 卓，杜 莹，等.大鼠脑组织中轻稀土元素含量相关性研究［J］.分析试验室，2007，26(7):108-111.

［14］Lee HW，Yang W，Ye Y，Liu ZR，Glushka J，Yang JJ.Isolated EF-loopⅢ of calmodulin in a scaffold protein remains unpaired in solution using pulsed-field-gradient NMR spectroscopy［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1598(1－2):80-87.

［15］Wei F，Xia XM，Tang J，Ao H，Ko S，Liauw J，et al.Calmodulin regulates synaptic plasticity in the anterior cingulate cortex and behavioral responses:a microelectroporation study in adult rodents［J］.J Neurosci，2003，23(23):8402-8409.

［16］Ye Y，Lee HW，Yang W，Shealy S，Yang JJ.Probingsite-specific calmodulin calcium and lanthanide affinity by grafting［J］.J Am Chem Soc，2005，127(11):3743-3750.

［17］Hu J，Yang X，Wang K.La3+stimulate the activity of calcineurin in two different ways［J］.J Biol Inorg Chem，2005，10(6):704-711.

［18］Lepsík M，Field MJ.Binding of calcium and other metal ions to the EF－hand loops of calmodulin studied by quantum chemical calculations and molecular dynamics simulations［J］.J Phys Chem B，2007，111(33):10012-10022.

［19］Tardito D，Tiraboschi E，Kasahara J，Racagni G，Popoli M.Reduced CREB phosphorylation after chronic lithium treatment is associated with down-regulation of CaM kinaseⅣ in rat hippocampus［J］.Int J Neuropsychopharmacol，2007，10(4):491-496.

［20］Barco A，Alarcon JM，Kandel ER.Expression of constitutively active CREB protein facilitates the late phase of long-term potentiation by enhancing synaptic capture［J］.Cell，2002，108(5):689-703.

［21］Miyamoto E.Molecular mechanism of neuronal plasticity:induction and maintenance of long-term potentiation in the hippocampus［J］.J Pharmacol Sci，2006，100(5):433-442.

［22］Guzowski JF.Insights into immediate-early gene function in hippocampal memory consolidation using antisense oligonucleotide and fluorescent imaging approaches［J］.Hippocampus，2002，12(1):86-104.