异黄酮对高频电磁场致雌性性腺毒性的保护作用

徐幽琼，连 荣，汪家梨，陈 昱，陈国兴，张文昌

(1.福建省福州市疾病预防控制中心，福建福州 350004;2.福建医科大学公共卫生学院，福建福州 350004)

高频电磁场(high frequency electromagnetic field，HF-EMF)指频率在100～300 MHz的电磁辐射，在鞋业的高频胶合、塑料行业的塑料热合、机械行业的淬火金属熔炼、电子行业的显像管制造过程中相当常见［1］。前期研究显示，女工暴露于30 MHz的 HF-EMF 100～400 V·m－1可引起月经紊乱和性激素水平的改变［2］;雌性大鼠连续暴露HF-EMF 100～1600 V·m－156 d对性腺也有毒性作用，卵巢损害出现较早［3］。大豆异黄酮(isoflavones，IF)具有淬灭体内异常增多的自由基与调节细胞基因表达等生物活性，国外许多学者将其用于抗各种频率辐射治疗［4－5］，效果较好，且 IF具有植物雌激素样的作用，对卵巢有保护作用。但IF是否对制鞋业常见HF-EMF频率(30 MHz)及作业现场常见的接触剂量25～400 V·m－1的雌性性腺毒性具保护效应，近20年未见文献详细报道。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

清洁级Wistar雌性大鼠60只，2月龄，体重160～180 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，批号:SCXK(泸)2003-0003。IF，华北制药股份有限公司生产，批号20040405，纯度81.28%;卵泡刺激素(follicle-stimnlating hormone，FSH)、黄体酮生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)和孕酮(progestogen，P4)放免试剂盒由北京北方生物制品研究所提供;DeadEndTMFluorometric TUNEL System试剂盒，由美国Promega公司生产。

1.2 动物分组及给药

60只大鼠按体重分层随机分为5组，即IF对照组与 HF-EMF 25，100，400和1600 V·m－1组，每组12只。大鼠每日 ig给予 IF 150 mg·kg－1，除 IF对照组外，其余大鼠均置于辐射源上下两极板中央区内(电磁波平行于上下两极板传播)，频率30 MHz，电场强度为 25，100，400 和 1600 V·m－1，其脉冲上升时间20 ns，持续时间3 s，间隔时间2 s。全身辐射8 h，每周连续照射5 d，停2 d，共8周。

1.3 黄体生成素，卵泡刺激素，雌二醇和孕酮的测定

制备血清，采用放免法(RIA)，将被测培养液和125I标记的E2(P4，FSH和LH)衍生物与定量的兔抗加在一起，混匀后37℃孵育1 h(FSH和LH为20 h)，待反应平衡后，加入分离剂，离心(1710 g×15 min)，吸去上清游离部分，应用智能放免γ测量仪测定各管沉淀部分的放射性计数(cpm)。

1.4 大鼠动情周期判断标准

辐射第48～56天，每天早7:00，晚7:00应用阴道细胞涂片法［20］观察大鼠动情周期的变化情况，低倍镜观察阴道脱落细胞的变化，判断动情周期。

1.5 卵巢脏器系数的计算及各级卵泡数目测定

辐射第56天后，待大鼠进入动情期(阴道细胞涂片法判断)处死，立即取大鼠血与卵巢。卵巢称重，并计算卵巢脏器系数=〔脏器质量(g)/体重(g)×100〕。卵巢标本置于10%中性甲醛缓冲液固定、冲洗、脱水与包埋，每个卵巢5μm连续切片105张，每隔20张取1张切片，用HE染色法计算卵巢中各等级卵泡的数目构成比。每个卵巢标本取5张切片，每组随机选6个标本。

1.6 电镜观察卵巢细胞超微结构的改变

每组随机选2个标本，在大鼠未处死前迅速取其卵巢，冰上用锋利的刀片取大小1 mm3左右的卵巢组织，立即放入固定液。3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，乙醇-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋;超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄影。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 异黄酮对高频电磁场雌性性腺毒性大鼠动情周期的影响

如表1所示，与IF对照组比较，HF-EMF 1600 V·m－1组动情间期时间明显延长(P ＜0.01)，动情前期、动情期和动情后期时间各组间比较，差异无统计学意义。

2.2 异黄酮对高频电磁场雌性性腺毒性大鼠血清激素水平的影响

如表2所示，IF给药后，随辐射剂量的增大，各组血清LH和FSH水平呈上升趋势，E2和P4水平呈下降趋势，与 IF对照组比较，HF-EMF 1600 V·m－1组的 LH 水平显著增高(P ＜0.01);FSH，E2与P4水平各组比较差异无统计学意义。

2.3 异黄酮对高频电磁场雌性性腺毒性大鼠卵巢湿重及脏器系数的影响

如表3所示，HF-EMF 25～1600 V·m－1与 IF对照组比较大鼠卵巢湿重及卵巢脏器系数无明显差异。

2.4 异黄酮对高频电磁场雌性性腺毒性大鼠各级卵泡数目构成比的影响

如表4所示，与IF对照组比较，HF-EMF 1600 V·m－1各组黄体数目构成比、HF-EMF 400和1600 V·m－1组闭锁卵泡构成比明显升高(P ＜0.01)，HF-EMF 1600 V·m－1组初/次级卵泡构成比、成熟卵泡构成比显著降低(P＜0.01);原始卵泡构成比无明显差异。

2.5 异黄酮对高频电场磁雌性性腺毒性大鼠卵巢细胞超微结构的影响

图1显示，与 IF对照组比较，HF-EMF 1600 V·m－1组异染色质增多，成块状，染色质边集，线粒体出现水肿，基质变稀，电子密度明显下降，甚至空泡状，线粒体嵴变短而少，甚至发生断裂;HF-EMF 400 V·m－1组有小部分细胞核出现染色质成块、边集，线粒体也出现少量异常;HF-EMF 100 V·m－1组细胞核膜大部分是完整的，核仁也较清楚，但少部分细胞核染色质成块，核仁边集，甚至出现核固缩，线粒体嵴变短而少，HF-EMF 25 V·m－1组常染色质多见、异染色质少见;在细胞质中可见丰富的线粒体，多呈椭圆形和菱形，结构大部分较完整，板状嵴较清楚完整。

表1 异黄酮(IF)对高频电磁场(HF-EMF)所致大鼠动情周期影响Tab.1 Effect of isoflavones(IF)on estrus cycles in rats during the high frequency electromagnetic field(HF-EMF)exposure

表2 IF对暴露于HF-EMF的大鼠激素水平的影响Tab.2 Effect of IF on serum hormones levels in rats exposed to HF-EMF

表3 IF对暴露于HF-EMF的大鼠卵巢湿重及脏器系数影响Tab.3 Effect of IF on organ wet weight and organ coefficient in rats exposed to HF-EMF

表4 IF对HF-EMF致大鼠各级卵泡数目构成比影响Tab.4 Effect of IF on the constituent ratio of the different follicles in rats ovaries

图1 IF对暴露于HF-EMF的雌性大鼠卵巢细胞超微结构的影响〔醋酸铀-柠檬酸铅染色 ×2500(A)，×3600(B)，×7000(C)，×9000(D 和E)〕.A－E:分别为HF-EMF 0(IF对照)，25，100，400和1600 V·m－1组.Fig.1 Effect of IF on ultramicrostructure of cells of the ovaries inferior chronicity in rats exposed to HF-EMF〔Uranium acetate-lead citrate staining ×2500(A)，×3600(B)，×7000(C)，×9000(D and E)〕.

3 讨论

目前职业性有害因素对女(雌)性生殖系统的影响已引起广泛重视［6－7］，尤其是电磁辐射对生殖系统影响已成为全球性公共卫生热点问题［8－9］。IF是一类天然植物雌激素，主要包括染料木素、大豆黄素及少量的黄豆素。IF的结构与内源性雌二醇相似，主要与雌激素受体β相结合，可发挥雌激素和抗雌激素作用［10－11］。一般认为，IF在低浓度时发挥雌激素作用，而在高浓度时有抗雌激素作用［12－13］。该实验采用文献报道认为有抗辐射作用的IF 150 mg·kg－1作为实验剂量［14］。

动情周期观察结果显示，与IF对照组比较，只有HF-EMF 1600 V·m－1组大鼠动情间期时间显著延长;与笔者前期实验结果相比［3］，HF-EMF 100 V·m－1与400 V·m－1组动情前期明显延长，HF-EMF 400 V·m－1组动情前期时间明显缩短，结果表明，ig给予IF后，动情前期时间(即卵泡发育时间)已转为正常，虽然动情间期时间有延长，但整个动情周期时间延长不明显。提示IF对动情前期和动情间期有影响，尤其是对HF-EMF 100和400 V·m－1组影响较大。

基础研究显示［15］，雌性动情周期正常与否有赖于下丘脑-垂体-卵巢轴正常的调节，在这一性腺轴中，FSH，LH，E2和P4激素是维持正常动情周期最主要的激素。从前期研究结果［3］可知，HF-EMF对大鼠性激素水平的影响主要是促进垂体合成与分泌LH，抑制卵巢合成分泌E2和P4;ig给予大鼠IF后，各组大鼠E2水平上升，LH水平下降。其中HF-EMF 100～400 V·m－1组E2水平显著上升，LH水平显著下降。其原因可能是IF的结构与E2相似，在体内低E2水平情况下，发挥E2作用，解除辐射后体内E2水平降低，使负反馈(E2和P4水平下降导致负反馈到下丘脑和垂体，促进垂体更多地合成与分泌LH)减弱，致使IF处理的大鼠血清LH水平比未用IF处理的大鼠低。

从前期研究结果［3］提示，HF-EMF对大鼠生殖内分泌功能损伤的早期表现在卵巢，本文大鼠用IF处理后，HF-EMF 100 V·m－1组初/次级卵泡数、成熟卵泡数构成比有上升趋势，而闭锁卵泡与黄体数目构成比有下降趋势;HF-EMF 400 V·m－1组初/次级卵泡数构成比有上升趋势，但闭锁卵泡构成比也呈显著增加，成熟卵泡数构成比则无显著上升;HFEMF 1600 V·m－1组大鼠初/次级卵泡数、成熟卵泡数构成比显著减少，闭锁卵泡与黄体数目构成比显著增加。由此可见，IF有促进卵泡发育作用，但对高辐射剂量组效果不明显，尤其是HF-EMF 1600 V·m－1组。基础研究显示，E2可促进卵泡发育成熟，LH主要促使卵泡形成黄体，因此IF进入鼠体内，使E2水平上升，促进卵泡发育，并同时使LH水平下降，抑制卵泡形成黄体。

透射电镜观察卵巢细胞超微结构的结果显示，ig给予IF后，HF-EMF 100～400 V·m－1组大鼠卵巢细胞核出现核固缩明显减少，线粒体出现水肿数目下降，尤其是 HF-EMF 100 V·m－1，但 HF-EMF 1600 V·m－1组的细胞核里染色质边集较多见，有的甚至出现核崩解，线粒体出现肿胀、水肿数目明显增多，有的甚至出现空泡状，这些细胞形态学的改变必将引起卵巢分泌功能的损伤，使卵泡发育与闭锁出现异常，相应动情周期也出现变化，这与本次研究结果相一致。

总而言之，在本实验条件下观察到IF对亚慢性暴露于HF-EMF 25～400 V·m－1雌性性腺毒性有较好的保护效应作用，具体表现为IF可提高血清中E2水平，促进卵泡发育，抑制卵泡闭锁与黄体形成，使动情周期维持稳定而达到对HF-EMF性腺毒性保护效应。未观察到IF对高剂量(1600 V·m－1)亚慢性暴露HF-EMF雌性性腺毒性有较好的保护效应。

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