雷公藤甲素急性中毒对大鼠心肌的损伤

王 菡，黄光照，郑 娜，刘 良

(1.三亚市人民医院病理科，海南三亚 572000;2.华中科技大学同济医学院法医学系，湖北武汉 430030)

雷公藤具有抗炎、免疫调节和抗生育等作用［1］。雷公藤甲素(triptolide，TP)是雷公藤的主要有效成分，具有较强的免疫抑制作用［2］，并用于抗器官移植排斥反应［3］。但 TP有很高的急性毒性［4］，服用中毒早期即可出现心功能障碍的症状，表现为心前区疼痛、血压下降、心律失常，甚至出现顽固性心源性休克而发生急性循环衰竭［5］。本研究ig给予大鼠TP，制备大鼠TP急性中毒模型，观察TP急性中毒大鼠心脏功能的变化和心肌组织病理学改变，探讨TP心脏毒性作用，为TP中毒的临床救治和毒理学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药品、试剂和仪器

成年SD雄性大鼠60只，体重190～240 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(鄂)2007－0009。TP购自福建省医学科研所，纯度99%;浓缩型小鼠心肌肌钙蛋白(cardiac troponin T，CTn T)单克隆抗体和SP法免疫组化测定试剂盒购自福州迈新生物技术公司。BL-420E+生理功能实验系统由同济医学院病理生理教研室提供。

1.2 雷公藤甲素半数致死量的测定

采用上下增减剂量法［6］测TP的LD50。将每次TP用量及大鼠的结局均输入急性毒性实验统计学软件(AOT425StatPgm)，程序自动给出实验的终点剂量。

1.3 动物分组及给药

TP以少量丙二醇溶解，4℃冰箱保存，实验时以生理盐水稀释至所需浓度。大鼠随机分为正常对照组，TP 0.6，1.2 和2.4 mg·kg－1组，每组15 只;TP 一次性ig给予，给药体积为10 ml·kg－1;正常对照组给予等体积生理盐水。实验前大鼠适应性喂养3 d，给予TP前禁食12 h，自由进水，给药后禁食4 h。

1.4 观察大鼠表现及测定心电图

给予TP后动态观察各组大鼠的外观体征、行为活动等一般情况。每组随机取3只大鼠记录心率改变。定时记录Ⅰ导联给药前(记为－1 h)、给药后15，16，18和20 h心电图。连续测量5个心动周期，取其平均值。

1.5 血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性检测

每组随机取5只大鼠，给药前取血测定血清CK和LDH活性作为自身对照，3 d后ig给予TP，20 h后尾静脉采血，Aeroset全自动生化分析仪检测LDH和CK活性。

1.6 心肌组织病理学观察

给予TP后72h处死大鼠，于心脏右心房下横切取材，制成石蜡切片，HE染色观察。采用全自动彩色图像分析系统，对心肌损伤进行半定量分析。每组9只大鼠，每只3张切片，每张切片放大200倍，随机取4个无重叠视野于镜下观察。将出现心肌细胞肿胀、空泡变性、溶解坏死和收缩带坏死等病理改变的心肌损伤区域圈出，由图像分析系统采集圈出部分的数据，测定每个视野心肌损伤面积占视野总面积的百分比，反映心肌损伤程度。

1.7 心肌超微结构变化的观察

每组随机取2只大鼠，用刀片于心耳下横切面左心室近室间隔处取1～2 mm2心肌组织，2%戊二醛 (pH 7.4，4℃)固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察超微结构变化。

1.8 免疫组织化学法测定心肌肌钙蛋白分布

按照试剂盒说明书用SP法进行CTn T免疫组化染色。从每组制备的石蜡切片中随机选择10张，经过烤片，脱蜡，梯度乙醇脱水，3%H2O237℃孵育，PBS冲洗，正常羊血清工作液封闭后，滴加抗CTn T抗体4℃孵育过夜，DAB显色。棕褐色为CTn T免疫阳性反应。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 雷公藤甲素的急性毒性

用急性毒性实验统计学软件AOT425StatPgm上下增减剂量法检测结果表明，雄性大鼠ig给予TP，LD50值为 1.19 mg·kg－1，95% 可信区间为 1 ～1.75 mg·kg－1。

2.2 TP急性中毒大鼠一般症状和死亡率

给予TP后5 h，TP 1.2 和 2.4 mg·kg－1组大鼠活动度减低，反应迟钝，食量减少甚至拒食，眼角分泌物增多。TP 2.4 mg·kg－1组大鼠出现抽搐、昏迷、死亡，死亡多发生在给药后16～34 h，死前表现为畏缩不动，潮式呼吸，可持续3～4 h。给予TP后72 h，TP 0.6，1.2 和 2.4 mg·kg－1组大鼠分别死亡 1/15，8/15和14/15。

2.3 TP急性中毒大鼠心率和心电图的改变

给予TP 后15 ～20 h，与对照组比较，0.6 mg·kg－1组大鼠心率无明显变化，1.2 和2.4 mg·kg－1组心率明显减慢(表1);检测心电图发现，TP 3个剂量组均可见S-T段压低、T波高尖、Q波增宽和脱失等心电图改变(图1)。

2.4 TP急性中毒大鼠血清CK和LDH活性

与正常对照组相比，给予TP 20 h后，TP 0.6，1.2 和2.4 mg·kg－1组大鼠血清 CK 和 LDH 活性明显升高(表2)，与 TP剂量呈正相关(r值分别为0.95和0.94，P ＜0.01)。

2.5 TP急性中毒大鼠心肌组织结构的改变

光镜下观察发现，TP 0.6 mg·kg－1组可见灶性心肌细胞水肿(图 2B)，TP 1.2 mg·kg－1组心肌细胞肿胀、空泡变性明显(图2C)，TP 2.4 mg·kg－1组除可见空泡变性外，还出现细胞溶解坏死和收缩带坏死(图2D)。如表3所示，与正常对照组相比，TP 0.6，1.2和2.4 mg·kg－1组心肌损伤面积百分比明显升高，与 TP 剂量呈正相关(r值为0.80，P ＜0.01)。

表1 雷公藤甲素(TP)急性中毒对大鼠心率的影响Tab.1 Effect of acute triptolide(TP)poisoning on heart rate of rats

图1 TP急性中毒大鼠心电图的改变.动物处理见表1.大鼠ig给予TP后15～20 h检测心电图.A:正常对照;B，C和D:TP 0.6，1.2和 2.4 mg·kg－1.Fig.1 Electrocardiograms of rats with acute TP poisoning.

表2 TP急性中毒对大鼠血清肌酸激酶 (CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响Tab.2 Effect of TPacute poisoning on creatine kinase(CK)and lactate dehydrogenase(LDH)activities of rats

图2 TP急性中毒大鼠心肌组织病理改变(HE×200).动物处理见表 1.A:正常对照;B:TP 0.6 mg·kg－1;C:TP 1.2 mg·kg－1，箭头示心肌细胞肿胀;D:TP 2.4 mg·kg－1，箭头示心肌细胞溶解坏死.Fig.2 Pathological changes in myocardium of rats with acute TP poisoning(HE ×200).

表3 TP急性中毒对大鼠心肌的损伤作用Tab.3 Effect of acute TP poisoning on myocardial damage of rats

2.6 TP急性中毒大鼠心肌超微结构的变化

透射电镜观察发现，TP 0.6 mg·kg－1组可见细胞线粒体轻度肿胀，嵴减少，糖原颗粒减少(图3B);TP 1.2 mg·kg－1组心肌纤维断裂，线粒体明显肿胀，伴空泡样形成，嵴的数目亦明显减少(图3C);TP 2.4 mg·kg－1组肌小节亦有一定程度的断裂，肌原纤维模糊，残存线粒体结构消失(图3D)。

2.7 TP急性中毒对大鼠心肌细胞CTn T表达的影响

如图4所示，正常对照组心肌细胞胞浆内均呈弥漫棕褐色CTnT免疫阳性反应，纵切与横切的心肌纤维中均明显可见，未见灶缺失。TP 0.6 mg·kg－1组灶性心肌细胞胞质内棕褐色颗粒较淡，脱失;TP 1.2 mg·kg－1组局部心肌细胞胞质棕褐色颗粒较淡，少数缺染;TP 2.4 mg·kg－1组心肌细胞棕褐色颗粒缺染区扩大。

图3 TP急性中毒大鼠心肌超微结构的变化.动物处理见表1.A:正常对照;B:TP0.6 mg·kg－1;C:TP1.2 mg·kg－1，箭头示心肌细胞线粒体空泡化;D:TP 2.4 mg·kg－1，箭头示心肌细胞肌原纤维断裂.Fig.3 Effect of triptolide on myocardium ultrastructure by transmission electron microscope.

图4 TP急性中毒对大鼠心肌细胞心肌钙蛋白表达的影响 (免疫组化 ×200).动物处理见表1.A:正常对照，箭头示心肌细胞均呈弥漫棕褐色阳性反应;B:TP 0.6 mg·kg－1;C:TP 1.2 mg·kg－1，箭头示心肌细胞细胞胞质内棕褐色缺染;D:TP 2.4 mg·kg－1，箭头示心肌细胞棕褐色颗粒缺染区扩大.Fig.4 Effect of triptolide on the expression of cardiac troponin T in myocardium(Immunohistochemistry ×200).

3 讨论

有报道部分服TP者可见传导阻滞、结性逸搏、S-T段下降、T波倒置等心脏受损的心电图表现［7］。本实验显示，给TP后大鼠自发活动减少、共济失调、呼吸抑制，出现明显的心电异常，与临床报道的心肌损害特征相似。

本实验观察到一次性给予TP后，大鼠血清心肌CK和LDH水平明显升高，呈现对TP的剂量依赖;心肌损伤面积也随TP剂量的增加而加大。提示TP的急性心脏毒性具有剂量相关性。HE染色结果显示，TP所致急性心肌损伤的病理学改变以心肌细胞肿胀，空泡变性为主，心内膜下心肌改变最明显，病变较重者全层心肌均可见。心肌的溶解坏死，病变范围和程度随着TP剂量的增加而加重。大剂量下还观察到不同程度收缩带坏死，轻者仅见于心外膜下心肌，重者心外膜、内膜下心肌均可见，呈条带状、结节状分布。心肌收缩带坏死又称为凝固性肌溶性坏死，被认为是心肌急性缺血的形态学特征［8］，在其他中药急性中毒的心肌也可观察到［9］。给予TP后16 h，大鼠即出现明显的心电异常，心动过缓、S-T段改变、Q波增宽、Q波缺失等心电图表现，可能与TP造成急性心肌缺血，循环衰竭有关。

从超微结构看，TP造成的心肌细胞损伤以线粒体的变化最明显。线粒体是心脏毒性常见的亚细胞靶点。Su等［10］报道 TP处理组的 Lewis肺癌细胞(LLC)染毒后4 h即可检测到细胞线粒体转换孔开放，线粒体膜去极化以及ATP生成障碍。本实验观察到TP中毒的心肌细胞早期即可出现线粒体肿胀，基质密度降低，剂量增大时可出现嵴紊乱、断裂，线粒体空泡化，结构消失。由于线粒体结构和功能的改变，可以影响细胞呼吸链电子传递，使氧化磷酸化异常。而细胞能量代谢障碍，可加重细胞内ATP耗竭，使依赖ATP的离子泵和钙转运调节过程失调，导致细胞主动运输障碍而引起细胞肿胀、空泡变性直至溶解坏死。

大鼠心肌CTn T免疫组化显示，较高剂量TP引起心肌细胞中CTn T明显缺失。CTn T是心肌的结构蛋白，也是一种检测心肌损害高敏感和特异性标志物［11］。当心肌细胞损伤时，细胞膜破裂，胞浆内游离CTn T释放，若损伤进一步加重，则CTn T与肌原纤维分离并持续释放入血。Chen等［12］报道，TP之所以能够使调控细胞骨架的基因B1247008以及调控铁传递蛋白受体的基因BC054522表达上调，与TP破坏细胞骨架损伤细胞膜有关。由此可见，TP所致心肌损伤出现CTn T缺失可能与细胞膜性结构破坏有关。由于CTn T是维持心肌细胞正常收缩耦联的关键蛋白［13］，CTn T缺失也意味着该区域心肌纤维结构毁坏，心肌功能丧失［14］。

综上所述，TP的急性毒性与急性心肌损伤密切相关，且具有剂量相关性。心肌超微结构改变和CTn T缺失提示TP的心肌损伤作用可能与线粒体损伤、细胞膜破坏有关。

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