耐力训练对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表达的影响

谢 谨，龚豪杰，张 缨

耐力训练对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表达的影响

谢 谨1，龚豪杰1，张 缨2

目的：研究耐力训练对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表达的影响，探讨耐力训练中AMPKα2调节脂肪酸代谢的可能途径。研究方法：两月龄C57BL/6J野生（WT）和AMPKα2基因敲除（KO）小鼠各20只，各自随机分为安静对照组，耐力训练组，每组10只。两训练组进行4周，每天1 h，速度为12 m/min的跑台训练，测定股四头肌CPT-1 mRNA和蛋白表达以及血清FFA、TG水平。结果：4周耐力训练之后，WT鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表达，与安静对照组相比均显著升高，且两训练组之间无显著差异。结论：耐力训练中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游调节因子，可能有其他途径参与CPT-1表达的调节。

耐力训练；AMPKα2；CPT-1；脂肪酸氧化

5'-腺苷酸活化的蛋白激酶（5'-AMP-activated protein kinase，AMPK）是真核生物中能量变化的感受器，AMPK在运动中被激活伴随骨骼肌脂肪酸氧化作用的增强[1-2]。肉毒碱棕榈酰转移酶-1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1）是长链脂肪酸进入线粒体进行脂肪酸β氧化的限速酶，在脂肪酸代谢过程中起关键的调控作用。多项研究[3-5]表明，耐力运动能增加CPT-1在骨骼肌中的表达。这种运动训练后骨骼肌CPT-1表达增加是否与AMPK有关呢？因此，本研究以AMPKα2基因敲除和野生小鼠为研究对象，通过耐力训练观察野生和基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表达以及对血甘油三酯（TG）、血游离脂肪酸（FFA）的影响，探讨耐力训练中AMPKα2调节脂肪酸代谢的可能途径。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物分组

健康两月龄C57BL/6J野生（WT）小鼠和AMPKα2基因敲除（Knockout，KO）小鼠各20只（由Department of Endocrinology，Metabolism and Cancer， Institute Cochin， UniversitéParis Descartes，France提供两只AMPKα2基因敲除鼠，并由中国医学科学院动物研究所帮助保种繁殖），体重（18±2）g，根据体重随机分为4组，每组10只：野生安静对照组（C），野生耐力训练组（S），基因敲除安静对照组（CK），基因敲除耐力训练组（SK）。

1.2 实验动物饲养与运动方式

所有小鼠均在北京体育大学动物饲养房中饲养，每笼4～5只，室内温度（20～25）℃，相对湿度50%～70%，每天光照12 h，自由进食，饮水，国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。两安静对照组小鼠不施加运动负荷，正常笼中饲养。两耐力训练组小鼠采取每天1 h，每周6天，持续4周的跑台运动，其中第1天跑台速度为8 m/min，第2天10 m/min，第3天达到预定强度12 m/min，并维持此强度至4周训练结束。

1.3 取 材

最后一次训练结束即刻开始禁食，12 h后取材。乙醚麻醉，摘除双侧眼球取眼血，后立即取双侧股四头肌，迅速投入液氮，再转移至-80℃冰箱保存。血样静置30 min，4℃离心机3 000 r/min 20 min分离血清后，存于-20℃待用。

1.4 测定方法

1.4.1 RNA与蛋白样品的制备 （1）总mRNA的提取。取骨骼肌50～100 mg在液氮环境下研磨成粉末后移入离心管中，加1 mLTrizol匀浆，颠倒混匀15 s，冰上静置5 min后加0.2 mL氯仿，震荡，冰上静置5 min后12 000 r/min，4℃离心15 min，取上清液（约400 μL）移入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温下静置10 min，12 000 r/min，4℃离心15 min，弃上清，加入75%乙醇（用DEPC水配制）1 mL，7 500 r/ min，4℃离心10 min，弃上清，再次用75%乙醇洗涤，弃上清，在超净台中晾干，溶于10 μLDEPC水。最后用琼脂糖凝胶电泳检测完整性。

（2）蛋白提取。取骨骼肌100 mg在液氮环境下研磨成粉末后移入离心管中，加入蛋白裂解液（Tris-Cl、NaCl、EDTA、Tritonx-100、PMSF）1 mL匀浆，12 000 r/min，4℃离心1 h取上清。

1.4.2 指标测定方法 （1）骨骼肌AMPKα2mRNA及CPT-1mRNA表达。采用实时荧光定量（Real-time PCR）两步法。先进行逆转录（RT）部分，杭州朗基科学仪器有限公司生产的PCR扩增仪，型号MG96+/Y，RT-PCR试剂盒由Promega公司生产。具体反应条件：70℃ 5 min；42℃ 1 h；70℃ 15 min。合成的cDNA于-20℃储存备用。7 300荧光定量PCR仪和荧光染料反应体系（SYBRR Green PCR Master Mix）购自美国应用生物系统公司（Applied Biosystems）。引物用引物设计软件（Primer 5）设计，并经BLAST验证后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。实时荧光量数值由实时定量PCR仪（StepOne实时荧光定量PCR系统，Applied Biosystems）读取，目标基因表达结果以比较CT法相对定量。目标基因=2-△△CT。

表1 引物序列Table 1 Gene Primer sequences for PCR

（2）骨骼肌AMPKα2及CPT-1蛋白表达。用western blot法测定，先用考马斯亮蓝法测定总蛋白量，计算出蛋白上样量后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出目的蛋白（AMPKα2，CPT-1）和内参蛋白（β-actin），再转移置硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶封闭30 min，1抗（1：1 000）4℃孵育过夜，1×TBST洗涤3次，1×TBS洗涤一次。室温下二抗（1：2 000）孵育1 h，1×TBST洗涤3次，1× TBS洗涤1次。AMPKα2的一抗为AMPKα2，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。CPT-1的一抗为CPT-1，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。内参的一抗为 β-actin，mouse monoclonal IgG1，Santa Cruz Biotechnology，Inc。所有二抗均为 donkey anti-goat IgG-HRP，Santa Cruz Biotechnology，Inc。曝光前加入发光液反应1 min，入暗室用X光片压片曝光。用生物电泳图像分析软件（FR-980 Smart View，复日科技）拍照，最后用ImageJ软件读取条带积分灰度值，结果用相对积分灰度值（目的/内参）表示。

（3）血清甘油三酯（Triglyceride，TG）和血清游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）水平的测定，试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。

1.5 统计学处理

所有实验数据用SPSS13.0软件处理，计算均值和标准差（平均数±标准差），统计方法采用双因素方差分析，组间差异显著性标准为P<0.05达到显著性水平。

2 实验结果

2.1AMPKα2mRNA表达和蛋白表达

由表2可见，经过4周耐力训练，野生鼠骨骼肌AMPKα2 mRNA和蛋白表达水平，与安静对照组相比均显著升高（P<0.05）。

Table表 2 2 Th耐e力 ef训fec练t 对of eAnMdPurKaαnc2em trRaNinAin、y蛋 o白n 表AM达P水Kα平2的m影RN响A and protein expression （n=8）

2.2 CPT-1mRNA表达和蛋白表达

由图1和图2可见，4周耐力训练之后，野生鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表达，与安静对照组相比均显著升高，且两训练组之间无显著差异。

图1 耐力训练CPT-1mRNA表达的影响Figure 1 The effect of endurence training on CPT-1 mRNA expression

图2 耐力训练CPT-1蛋白表达的影响Figure 2 The effect of endurence training on CPT-1 Protein expression

2.3 血清TG和FFA变化

由表3可见，4周耐力训练之后，与安静对照组相比，野生鼠血清TG值无明显变化，而KO鼠血清TG值显著下降（P<0.05）。各组血清FFA之间均无显著性差异。

Table3 Blo表od3s se各ru组m小FF鼠Aa血n清dTTGGle和velFsFinAth水ef平ou比rtr较eatmen（tmgmrooul/pLs）

3 分析讨论

3.1耐力训练对AMPKα2mRNA和蛋白表达的影响

Wojtaszewski J F等[6]让6名健康男子以45%最大摄氧量强度进行功率自行车试验直到力竭，测得运动中AMPKα2活性连续性升高，在力竭时达最大值。Durante P E等[7]对大鼠的研究也发现，7周递增负荷跑台训练以后，股四头肌AMPKα2的活性显著升高。Fr准sig C等[8]通过人体实验发现3周耐力训练并未增加股外侧肌中AMPKα2的蛋白表达，大鼠实验也发现递增负荷耐力训练后AMPKα2活性显著增强，但蛋白表达变化甚微[7]。本次实验结果表明4周耐力训练以后，野生耐力训练组小鼠股四头肌AMPKα2的mRNA表达水平和蛋白表达水平都明显高于野生安静对照组（见表2），表明该耐力训练能够明显增加野生鼠骨骼肌AMPKα2mRNA和蛋白表达。

3.2 耐力训练对CPT-1mRNA和蛋白表达的影响

Tunstall R J等[3]研究发现，持续9天运动使CPT-1mRNA表达显著增加57%（P<0.05）以及Russell A P等[4]的研究表明9周耐力训练使CPT-1mRNA表达增加75%（P<0.01）。国内研究也表明8周有氧运动可以明显增加小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表达[5]。从本研究结果来看，经过4周跑台训练后，训练组小鼠骨骼肌内CPT-1mRNA和蛋白表达均明显高于安静对照组（见图2，图4），与以上研究结果相同。耐力训练能够增加CPT-1mRNA和蛋白表达，原因可能与脂肪酸供能特点有关，长时间、中低强度的耐力运动中，脂肪酸是提供能量的主要来源，CPT-1作为长链脂肪酸进入线粒体内膜的限速酶在脂肪酸供能过程中发挥重要作用。因此每天1 h，持续4周的反复训练可能在时间和次数上对刺激CPT-1转录和翻译水平上升产生积累效应，造成CPT-1mRNA和蛋白表达增多。

3.3 耐力训练对AMPKα2基因敲除鼠CPT-1表达水平及血脂的影响

CPT-1作为长链脂肪酸进入线粒体内膜的限速酶，控制着长链脂肪酸的β氧化过程[9]。丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA，MCA）可通过抑制CPT-1活性而阻碍长链脂肪酸的β氧化[10-11]。体外研究发现5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside（AICAR）能够激活骨骼肌中AMPK，最终减少MCA合成，并伴随骨骼肌脂肪酸氧化作用增强[12]，提示AMPK可能通过调节CPT-1而控制骨骼肌脂肪酸氧化过程。也有动物实验表明AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌内CPT-1mRNA含量比正常野生鼠低26%[13]。本实验结果显示通过4周耐力训练，S组CPT-1mRNA和蛋白表达较之C组分别增加1.0倍（P<0.05）和2.2倍（P<0.05），同样，SK组CPT-1mRNA和蛋白表达比CK组增加了0.5倍（P<0.05）和1.3倍（P<0.05），表明耐力训练中AMPKα2的敲除并没有影响CPT-1表达水平的上升。同时，并未发现CPT-1mRNA和蛋白表达在两种鼠间出现显著差异。近年来研究发现AMPKγ3也对骨骼肌脂肪酸代谢起重要调节作用[14-15]以及细胞外信号调节激酶 1/2（extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2）也参与调节运动中骨骼肌脂肪酸摄取和氧化过程。综上所述，运动对CPT-1表达的调节是一个复杂的过程，在耐力训练中AMPKα2可能不是CPT-1唯一调节因子，AMPKα2对CPT-1表达的影响可能被其他调节通路或机制所代偿，具体机制有待进一步探讨。

另外，同种基因型鼠耐力训练前后及野生和基因敲除鼠间血清FFA无显著性差异，推测FFA受多种因素的调节如激素leptin，因而血清中浓度相对恒定。但耐力训练后AMPKα2基因敲除鼠SK组比CK组血清TG水平显著下降（P<0.05），原因仍有待于进一步研究。

4结 语

4周耐力训练，AMPKα2基因敲除和野生型小鼠股四头肌中CPT-1mRNA和蛋白表达均显著性升高，且两种鼠间无显著差异，提示耐力训练中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游调节因子，可能有其他途径参与CPT-1表达的调节。

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Effect of Endurance Training on Skeletal Muscle CPT-1 Expression of α2-AMPK Whole-body Knockout Mice

XIE Jin1,GONG Haojie1,ZHANG Ying2
(1.Graduate School,Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Institute of Human Sports Science,Beijing Sport University,Beijing 100084,China)

Objective:To study the effect of endurance training on skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of α2-AMPK whole-body knockout (KO)mice.Meanwhile,we also explore the possible role of AMPKα2 in regulating fatty acid oxidation in endurance training.Methods:C57BL/6J wild-type (WT)mice (n=20)and α2-AMPK whole-body knockout(KO)mice (n=20),two months old,were randomly subdivided into control groups and exercise groups.Quadriceps femoris muscle was removed after 4 weeks treadmill running (12m/min,1h/day).Expression of CPT-1 mRNA and protein,blood serum FFA and TG levels were measured.Results:After 4 weeks endurance training,skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of WT and KO mice were significantly higher than control groups.At the same time,there were no significant differences between two exercise groups.Conclusion:AMPKα2 is not the only upstream regulatory factor of CPT-1 in endurance training,and there could have other factors which regulate CPT-1 mRNA and protein expression during this kind of training.

endurance training;AMPKα2;CPT-1;fatty acid oxidation

G 804.7

A

1005-0000（2010）01-0030-03

2009-12-22；

2010-01-10；录用日期：2010-01-12

北京市自然科学基金项目（项目编号：5072031）；卫生部人类疾病比较医学重点实验室开放课题基金（项目编号：ZDS200804）

谢 谨（1986-），女，安徽巢湖人，北京体育大学在读硕士研究生。

1.北京体育大学研究生院，北京100084；2.北京体育大学运动人体科学学院，北京100084。