可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元延迟整流钾电流的影响

方 丹 ，刘振宅 ，杨 卓

（1.天津医科大学生物医学工程系，天津300070；2.南开大学医学院）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种进行性神经退行性疾病，是老年痴呆最常见的原因。AD临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。AD的确切病因还不清楚，β淀粉样蛋白（amyloidβprotein,Aβ）增加已被广泛接受为其中枢病因性过程。Aβ是老年斑的主要成分，是由39~43个氨基酸残基组成的多肽，其主要神经毒性作用位于Aβ的氨基酸序列25~35[1]。许多研究证实，凝聚态Aβ具有神经毒性作用[2，3]，亦有研究提出，Aβ在纤维性沉积前，即可溶性Aβ也可产生神经毒性作用[4，5]，但其作用机制尚不清楚。海马是学习记忆的关键部位，对衰老变化易感。海马CA3区与空间辨别性学习记忆关系密切[6]。研究表明，海马神经元电压门控性钾通道与学习记忆密切相关[7]。对急性分离的海马神经元电压门控性钾电流的记录已有许多报道[8]，在脑片上记录全细胞电流更接近生理状态。因此，本研究采用膜片钳技术观察可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元IK的影响，探讨可溶性Aβ25-35的神经毒性作用机制，为研究Aβ25-35与AD发病关系提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠，鼠龄9~10 d，雌雄不限，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。

N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、已二醇-双（己-氨基乙基）四乙酸（EGTA）、三磷酸腺苷镁盐（Mg-ATP）、河豚毒素（TTX）、4-氨基吡啶（4-AP）、氯化四乙铵（TEA-Cl）、Aβ25-35均为 Sigma 公司产品。其余试剂为国产分析纯。

孵育液（mmol/L）：NaCl 125、KCl、NaH2PO41.25、MgCl21.3、CaCl22.4、NaHCO326、glucose 10，pH 用NaOH调至7.3。

电极内液 （mmol/L）：KCl117.5、MgCl22、HEPES 10、EGTA 5、Mg-ATP 2，pH 用 KOH 调至 7.3。

可溶性Aβ25-35溶液的配制：用超纯水配制成0.2mmol/L的母液，分装在安道夫管中，-20℃冷冻备用，实验时稀释到所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海马脑片的制备 参照文献[9]的方法并在此基础上加以改进：无菌条件下迅速将大鼠断头取脑，置于混合气（95%O2/5%CO2）饱和的冰冷（0~4℃）孵育液中约5min。将整个脑组织于冰盒上冠状切除小脑和大脑的前半部分,大脑后半部分用502胶垂直粘贴于振动切片机 （Leica,VT1000S）标本托上，在 0 ℃通混合气（95%O2/5%CO2）条件下,用振动切片机将脑组织切成350μm厚的冠状脑片，置于混合气饱和的孵育液中，室温（22~25℃）孵育1h备用。

1.2.2 膜片钳全细胞记录 玻璃微电极由PIP5型电极拉制仪（HEKA，德国）分两步拉制，充灌电极内液后阻抗为4~8MΩ。正置显微镜下选大鼠海马CA3区神经元细胞线行盲法全细胞记录。当电极尖端与细胞膜形成高阻封接（大于1GΩ）后，负压破膜，使电极内液与细胞内液相通，形成全细胞记录模式。滤波频率：2.9 kHz。采样频率：10 kHz，采样数据由Pulse软件自动记录，存储于计算机硬盘内。

在培养皿的孵育液中加入TTX、CdCl2和4-AP，终浓度分别为1μmol/L、0.3mmol/L和5mmol/L。电压钳模式下保持电位-70mV，给予-50mV至+90mV的阶梯去极化脉冲刺激，步幅+10mV，波宽100ms，频率0.5 Hz，记录正常生理状态下大鼠海马脑片CA3区神经元的IK；然后将可溶性Aβ25-35母液定量加入到培养皿中，使其达到所需浓度，孵育一定时间后，记录IK。所有实验均在室温（22~25℃）下进行。

1.3 统计学分析 采用Igor5.0和Origin7.5软件进行统计处理，计量资料以表示。加入可溶性Aβ25-35前后差异的显著性采用配对t检验判定，P＜0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元IK的抑制作用 图 1为加入 1.0μmol/L可溶性Aβ25-35前后记录的大鼠海马脑片CA3区神经元IK波形。A为加入Aβ25-35前记录的IK波形。B为加入Aβ25-3519min后记录的IK波形。膜电位+90mV时，可溶性 Aβ25-35使 IK峰值降低了（50.21±5.09）%。

2.2 可溶性Aβ25-35对IK作用的剂量-效应关系 图2为加入 1.0μmol/L、2.5μmol/L和 5.0μmol/L Aβ25-35后IK抑制率直方图。从图中看出，加入3个浓度的Aβ25-35后，对IK抑制率均在60%左右，无显著性差异。

2.3 可溶性Aβ25-35对IK作用的时间-效应关系 图3为加入1.0μmol/L Aβ25-35后IK的时间过程曲线。从图中看出，IK随Aβ25-35加入的时间延长而逐渐减少。加入Aβ25-3523min后，IK趋于稳定。

2.4 可溶性Aβ25-35对IKI-V曲线的影响 图4为加入1.0μmol/LAβ25-35前后IK的I-V曲线。表1为加药前后不同电位时IK峰值。从图4看出，加入Aβ25-35后，IK的I-V曲线逐渐降低，降低的幅度随去极化加强而增加，呈一定的电压依赖性。

表1 加入可溶性Aβ25-35前后不同电压下IK峰值对照表( ，n=8)

表1 加入可溶性Aβ25-35前后不同电压下IK峰值对照表( ，n=8)

与对照组比，*P<0.05，**P<0.01

加药前（pA）9.91±5.08 11.72±3.81 21.22±5.35 36.01±1.22 107.01±27.21 203.04±59.44 353.20±66.81 493.21±52.29 620.23±39.56 710.36±65.21 837.28±91.12 947.21±99.14 1040.39±93.19 1170.21±99.21 1314.44±57.29加药后（pA）7.81±1.20 8.22±5.70 20.51±6.14 35.12±15.52 98.21±13.54 168.13±31.53 280.31±61.62 375.21±29.21 465.47±41.21*532.36±55.01*612.24±26.31*661.36±29.23*710.26±29.51**783.36±41.32**820.01±43.63**膜电位（mV）-50-40-30-20-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

2.5 可溶性Aβ25-35对IK激活动力学特性的影响 利用公式G=I/（V-VK）将IK的电流值转换为电导值，式中G为电导，V为膜电位，VK为翻转电位。以电导值与最大电导值的比值（G/Gmax）对应膜电位绘制出加入Aβ25-35前后IK的激活曲线，所得曲线用Boltzmann方程 G/Gmax=1/{1+exp[-（V-Vh）/k]}进行拟合，式中Vh为半数激活电压，k为斜率因子。图5为加入5.0μmol/LAβ25-35前后IK的激活动力学曲线，从图中可以看出，加入Aβ25-35前后IK的激活动力学曲线均呈S形，加入Aβ25-35后激活动力学曲线显著左移。加入Aβ25-35前后IK半数激活电压Vh分别为 （5.88±0.67）mV 和（-2.81±0.76）mV（P＜0.05）；斜率因子k 分别为（18.58±1.63）mV 和（17.73±1.54）mV（P>0.05）。

3 讨论

电压门控性钾通道广泛分布于海马神经元，在调节神经元兴奋性等生理功能中起重要作用。IK是动作电位复极化过程的主要成分，影响动作电位的幅度、时程、发放频率和钙内流等[10]。本研究显示，可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元IK具有明显抑制作用，且呈时间依赖性和电压依赖性，但未表现出明显的浓度依赖性，分析可能与实验选择的浓度范围有关。有分析认为，可溶性Aβ25-35对IK抑制作用的一个可能的机制是可溶性Aβ25-35使大鼠海马CA3区神经元IK通道的数量减少；另一个可能的机制是可溶性Aβ25-35对大鼠海马CA3区神经元IK通道的激活门控产生了静电和/或变构的影响，改变了IK通道的特性[11]。本研究结果中，激活曲线左移，激活过程提前，使电流增大，说明可溶性Aβ25-35改变了IK通道的特性。但尚有研究显示，可溶性Aβ25-35对大鼠海马CA3区神经元IK通道亚型Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1的mRNA的表达有较明显的抑制作用[12]，说明延迟整流钾通道的数量减少，从而使电流减小。因为总的结果是可溶性Aβ25-35使延迟整流钾电流减小。因此，我们分析，可溶性Aβ25-35对IK的作用很可能是以上两种机制并存的。

由于延迟整流钾电流是细胞膜复极化的主要成分，控制神经元的Ca2+稳态和兴奋性，因此，可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元IK的抑制导致动作电位时程延长以及静息膜电位下降，从而促进细胞外Ca2+向细胞内流动，Ca2+无限制地内流将导致Ca2+超载，从而促进脂质过氧化和自由基的产生，增加细胞对氧化应激和兴奋性毒素的敏感性，加剧细胞损伤；同时，Ca2+超载也会损伤氧化磷酸化，导致神经细胞能量不足，从而引起细胞功能紊乱甚至死亡[13]。此外，Ca2+稳态被破坏还影响淀粉样前体蛋白（amyloidβ protein precursor,APP）的代谢，使有神经保护作用的可溶性产物sAPPα的产生减少，Aβ产生增多，从而导致恶性循环[14]。因此，可溶性Aβ25-35对大鼠海马CA3区神经元IK的抑制作用可能是其产生神经毒性作用的机制之一。

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