α-干扰素对脐血来源的树突状细胞分化成熟及功能影响的体外研究

李来元 ，杜 智 ，朱争艳 ，吴尘轩 ，高英堂 ，王 鹏 ，白 同 ，姚 晨

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市第三中心医院，天津市人工细胞重点实验室）

树突状细胞（dendritic cells,DC）是体内功能最强大的专职抗原提呈细胞之一，其主要功能是摄取、加工处理和提呈抗原，刺激初始T细胞活化，从而启动特异性免疫应答，在T淋巴细胞和肿瘤细胞的相互作用中起桥梁作用。大量资料显示，在诱导DC成熟过程中通过添加不同细胞因子可增强其抗肿瘤免疫应答的能力，因此，DC成熟与否对其功能的发挥至关重要。Randvanyi等[1]报道低浓度(10～100 U/ml)α-干扰素 （IFN-α）能促进外周血单核细胞来源的DC成熟，IFN-α可能通过调节DC的功能来调节DC的免疫反应。为进一步探讨高浓度 (500 U/ml)IFN-α对DC成熟的影响，笔者在常规培养条件中加入不同剂量的IFN-α，以观察IFN-α对DC表型和功能的影响，为临床应用DC进行细胞免疫治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 正常足月剖宫产新生儿脐血10份由天津市第三中心医院产科提供；IFN-α（Biolegend LTD）；rhIL-4、rhGM-CSF、TNF-α （Pepro Tech EC LTD）；PE anti-HLA-DR、FITC anti-CD 1a、FITC anti-CD 83、FITC anti-CD 86、PE anti-CD 14、FITC anti-CD 40 （BD Biosciences LTD）；丝裂霉素（协和发酵株式会社）；IL-12、IFN-γ、IL-10 ELISA 试剂盒(ANTIBODYSHOP LTD)；T 细 胞 尼 龙 毛 柱 （GIBCO LTD）；Epics Altra 流式细胞仪 （BECKMAN COULTER LTD）；全自动酶标仪 Model-353（Fortune Labsystems LTD）。

1.2 方法

1.2.1 脐血DC的体外诱导 取新鲜抗凝脐血50ml，用HES液自然沉降法分离单个核细胞，以PRMI-1640完全培养液悬浮细胞，计数并调整细胞浓度为2×106个/ml。将单个核细胞接种于6孔培养板(2 ml/孔)，分 A、B、C 3 组，每组 2 孔，置于 37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h后，收集悬浮的非贴壁细胞备用。贴壁的单核细胞加入1000 U/ml rhGM-CSF、500 U/ml rhIL-4和INF-α诱导培养，其中A组IFN-α 0 U/ml、B 组 IFN-α100 U/ml、C 组 IFN-α 500 U/ml； 第 3 天全量换液，第5天各组加入20 U/ml TNF-α。培养第7天收获成熟DC备用，而上清液用于IL-12、IFN-γ和IL-10的ELISA检测。

1.2.2 DC的形态观察及流式细胞仪检测 每日倒置显微镜下观察DC诱导过程中细胞形态及增殖情况，透射电镜观察DC超微结构并摄片。于培养第7天将每组其中一孔细胞浓度调到1×105个/ml，流式细胞仪检测细胞表型 HLA-DR、CD1a、CD14、CD40、CD83、CD86的表达率。

1.2.3 诱导成熟DC对同种异体T细胞增殖的影响收集1.2.1中非贴壁的单个核细胞，尼龙毛柱法纯化未致敏的初始型T淋巴细胞，以含1000 U/ml IL-2、10%FBS的PRMI-1640培养。将诱导成熟的DC用50 μg/ml丝裂霉素处理30 min，然后与T淋巴细胞按 1∶10、1∶50、1∶100 的比例加入 96 孔板共同培养72 h。于培养结束前4 h每孔加入20 μl MTT（l5 mg/ml），继续孵育 4 h后加入酸性异丙醇（含0.04 mol/L盐酸）100 μl/孔， 用酶标仪读取波长570 nm的吸光度OD(A)值，结果取3孔平均值。

1.3 统计学处理 所有统计分析应用SPSS13.0软件进行处理。计量资料以±s表示，计数资料以百分率(%)表示，两均数比较采用t检验，几个均数比较采用单因素F检验，S-N-K检验对数据进一步两两比较，P<0.05时具有统计学意义。

2 结果

2.1 脐血DC的形态学观察 倒置显微镜下观察，培养第5天时各组细胞大部分呈悬浮生长，细胞体积增大，B、C组细胞表面有少量树枝状突起，A组细胞未见突起（图1）；第7天时B、C组细胞体积进一步增大，细胞表面有明显树枝状突起，呈现典型的树突状细胞形态，以C组形态变化更明显（图2）；第7天扫描电镜下可见脐血来源DC胞体突起形成不规则状，细胞表面粗糙，层叠状皱襞明显可见，胞浆丰富，核大不规则，核质丰富（图3）。

2.2 流式细胞仪检测DC的表面标志 如表1所示，DC 表面成熟标志 HLA-DR、CD1a、CD83、CD86和CD40等的表达在B、C组较 A组有显著增高（P<0.05），HLA-DR、CD1a、CD83、CD86 等的表达在C组又显著高于B组（P<0.05）；同时，DC不成熟标志CD14的表达正好相反，在A组中高于B、C组（P<0.05）。

2.3 DC分泌细胞因子的观察 收集A组、B组、C组DC培养7 d的上清液，用ELISA法测定IL-12、IFN-γ和IL-10的含量，结果表明C组DC分泌的IL-12、IFN-γ 高于 A、B 组（P<0.05）；而 IL-10 的表达低于 A、B 组（P<0.05），见表 2。

表1 不同浓度IFN-α对脐血培养第7天DC表面标志物表达的影响(%，±s)

表1 不同浓度IFN-α对脐血培养第7天DC表面标志物表达的影响(%，±s)

与A组比较▲P<0.05；与B组比较#P<0.05

CD1a 20.09±1.86＃32.02±3.22▲37.95±1.91▲#CD8348.48±2.3053.01±2.7672.08±3.46▲#HLA-DR 78.14±1.7982.56±1.69▲89.36±2.37▲#CD1437.68±1.8831.64±2.38▲28.25±1.55▲#CD4023.00±1.9226.76±5.5830.06±2.59▲CD8676.40±1.9786.83±5.80▲96.10±1.10▲#组别ABC

表2 不同浓度rhIFN-α对脐血培养细胞第7天上清液细胞因子的影响（±s）

表2 不同浓度rhIFN-α对脐血培养细胞第7天上清液细胞因子的影响（±s）

与A组比较▲P<0.05；与B组比较#P<0.05

组别IL-12(pg)IFN-γ(pg)IL-10(pg)A25.18±1.6241.80±1.24＃39.49±1.73 B28.91±1.72▲42.49±1.0337.53±0.53▲C33.09±1.76▲#44.65±1.17▲#35.58±0.96▲#

2.4 MTT法检测DC刺激T细胞的增殖能力 收集A组、B组、C组培养7 d的悬浮细胞，进行同种异体T淋巴细胞混合反应，结果如图3，B组和C组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力显著高于A组（P<0.05）；C 组又显著高于 B 组（P<0.05）。

3 讨论

IFN-α广泛用于治疗恶性肿瘤、病毒性和免疫性疾病。目前研究提示，IFN-α能促进人外周血单个核细胞向DC分化和成熟，且能通过外周血单个核细胞诱导的 DC高表达 HLA-DR、CD80、CD86和CD54[2-5]；进一步能诱导机体产生获得性免疫，提高DC的成熟度可诱导产生高效细胞毒性T细胞[6-9]。因此深入探讨IFN-α对DC分化成熟及功能的影响，将有助于DC在细胞免疫治疗方面发挥更大的临床作用。

笔者应用IFN-α联合经典培养DC的细胞因子（rhGM–CSF/rh IL-4/TNF-α）诱导培养脐血单个核细胞生成DC，分别选择INF-α的最高临床血清浓度100 U/ml（B组）和超过临床血清浓度的大剂量500 U/ml（C组）作为实验组观察INF-α在DC培养中的作用。动态观察发现：B、C组在培养第5天即诱导出DC样细胞；7 d时流式细胞仪分析表明：B、C组DC的CD86（对同种异体T淋巴细胞增殖最重要的分子）表达较A组DC显著增高，B、C组的单核细胞特异性表面标志CD14较A组减少；混合淋巴细胞反应实验发现：B、C组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力较A组增强。说明上述两种浓度的IFN-α均可以促进DC成熟和功能的增强。我们的结果与 Luft等[2]、Daucr等[5]和 Tamir等[10]研究结果一致，Luft等[2]和 Tamir等[10]研究发现 INF-α 能够充分刺激DC的成熟、活化，能上调CD86/CD80/CD83等成熟DC表面分子的表达，具有刺激T淋巴细胞增殖的能力；Daucr等[5]研究表明IFN-α在含GM-CSF/IL-4的培养液中能促进单核细胞分化为成熟DC。本实验采用ELISA法检测进一步发现：B、C组诱导培养DC分泌的IL-12、IFN-γ较A组增高，且C组DC分泌功能较B组更强，说明在体外IFN-α能增强脐血诱导培养DC的分泌功能，更有利于细胞免疫及抗肿瘤免疫反应。

本实验提示，在体外INF-α有促进脐血单个核细胞向成熟DC转化的能力，此种方法培养的DC表达丰富的CD分子，具有高度刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力和高度分泌细胞因子的能力，此结果将为INF-α和DC联合应用于临床免疫治疗提供实验依据，同时为在体内重新评估INF-α对DC分化成熟和功能的影响奠定基础。

［1］Randvanyi LG,Banerjee A,Weir M,et al.Low levels of interferon-alpha induce CD86(B7.2)expression and accelerates dendritic cell maturation from human peripheral blood mononuclear cells[J].Scand J Immunol,1999,50(5):499

［2］Luft T,Pang KC,Thomas E,et al.Type I IFNs enhance the terminal differentiation of dendritic cells[J].J Immunol,1998,161(4):1947

［3］Santini SM,Di Pucchio T,Lapenta C,et al.The natural alliance bctween type I interferon and dendritic cells and its role in linking innate and adaptive immunity[J].J lnterferon Cytokinc Res,2002,22(11):1071

［4］Tough DF.Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation[J].Lcuk Lymphoma,2004,45(2):257

［5］Daucr M,Schad K,Daucr M,et al.IFN-alpha promotes definitive maturation of dendritic cells generated by short-term culture of monocytes with GM-CSF and IL-4[J].J Leukoc Biol,2006,80(2):278

［6］Jego G,Palucka AK,Blanck JP,et al.Plasmacytoid dendritic cells induce plasma cell differentiation through type I interferon and interleukin 6[J].Immunity,2003,19(2):225

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［9］Fukui H,Mitsui S,Harina N,et al.Novel functions of herbal medicinesindendriticcells:roleofamouisemenintumorinmunity[J].Microbiol Immunol,2007,51(11):1121

［10］Tamir A,Jordan WJ,Ritter M.Interferon-alpha-a is sufficient for promotingdendriticcellimmunogenicity[J].ClinExpImmunol,2005,142(3):471